B7-H1-PD-1通路在人原發(fā)性肝細胞癌中的研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：人原發(fā)性肝細胞癌中B7-H1的表達
　　 目的: 研究人原發(fā)性肝細胞癌中浸潤性白細胞的種類及B7-H1的表達水平。
　　 方法: 獲取人原發(fā)性肝細胞癌標本及癌巢周圍肝組織標本，一部分經(jīng)消化后，通過75%-100%雙層Ficoll 密度梯度離心法分離肝癌細胞或肝細胞以及組織浸潤白細胞，使用CD45、CD3、CD4、CD8、HLA-DR、CD14、CD11c、B7-H1、小鼠抗人I

2、gG1 同型對照及CD123 進行流式細胞染色，對比分析肝癌組織和癌周組織中以下細胞的比例及B7-H1 在各種細胞中的表達情況：CD45-的肝癌細胞或肝細胞、CD3+CD4+或CD3+CD8+T細胞、CD3-HLA-DR+巨噬細胞（即枯否氏細胞）、CD3-CD14-HLA-DR+CD4+CD11c+髓樣樹突狀細胞和漿細胞樣樹突狀細胞；取另一部分組織，固定在OCT 冰凍切片包埋劑中，制成冰凍切片用于熒光免疫組織化學檢查。
　　 結

3、果: 流式細胞分析及熒光免疫組織化學檢查均顯示：肝癌組織浸潤白細胞的數(shù)量比癌周組織高，但CD4+及CD8+T細胞、枯否氏細胞、髓樣樹突狀細胞和漿細胞樣樹突狀細胞在兩者中的比例沒有差別。肝癌細胞、T細胞、髓樣樹突狀細胞和漿細胞樣樹突狀細胞表達很低水平的B7-H1?？莘袷霞毎歉伟┘鞍┲芙M織浸潤白細胞中主要表達B7-H1的細胞，且肝癌組織中B7-H1+枯否氏細胞的比例高于癌周組織。
　　 結論:與癌周組織相比，人原發(fā)性肝細胞癌中有較

4、多白細胞浸潤，但各種白細胞的比例沒有差異，說明肝癌微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)的形成原因不是浸潤白細胞的數(shù)量和亞類的比例，而是白細胞的功能改變。其中枯否氏細胞表達高水平的B7-H1，其可能通過B7-H1/PD-1介導對T細胞的抑制。
　　 第二部分：肝癌微環(huán)境促進抗原提呈細胞表達B7-H1的機理
　　 目的: 研究肝癌微環(huán)境促進枯否氏細胞表達B7-H1的機理。
　　 方法:；分離正常人外周血單核細胞，磁珠分選CD14+細

5、胞，與人原發(fā)性肝細胞癌細胞系Hep G2 在Transwell 體系中共培養(yǎng)48 小時。比較B7-H1 在單獨培養(yǎng)的CD14+細胞與經(jīng)過共培養(yǎng)的CD14+細胞中的表達差異，并對比篩查培養(yǎng)體系中各種細胞因子濃度。使用ELISA 進一步檢測肝癌微環(huán)境中誘導B7-H1 升高的細胞因子，通過阻斷共培養(yǎng)體系中該細胞因子，或在CD14+細胞單獨培養(yǎng)時加入該種外源性細胞因子，最后檢測B7-H1的表達水平，確定肝癌微環(huán)境促進B7-H1表達的機理。

6、>　　 結果: CD14+細胞與Hep G2細胞共培養(yǎng)后，B7-H1表達明顯升高。通過篩查和ELISA檢測，確定共培養(yǎng)體系上清中TNF-α和IL-10的量較CD14+細胞或Hep G2細胞單獨培養(yǎng)時顯著增加。阻斷TNF-α或IL-10的作用，可降低CD14+細胞與HepG2細胞共培養(yǎng)體系中B7-H1的表達量。加入外源性TNF-α或IL-10 到單獨培養(yǎng)的CD14+細胞中可誘導B7-H1的表達上調。
　　 結論:外周血CD14+

7、細胞是組織浸潤巨噬細胞的前體，與肝癌細胞系共培養(yǎng)能促進CD14+細胞B7-H1的表達，其中的TNF-α與IL-10的表達升高是主要作用機理。這提示肝癌微環(huán)境中的TNF-α與IL-10是上調抗原提呈細胞B7-H1表達上調的主要因素。
　　 第三部分：人原發(fā)性肝細胞癌中PD-1的表達，對T細胞功能的影響及PD-1+細胞與B7-H1+細胞的定位
　　 目的: 研究人原發(fā)性肝細胞癌中浸潤性T細胞PD-1的表達情況及的表達水平及其

8、對T細胞功能的影響，并確定PD-1+細胞與B7-H1+細胞在空間上的關系。
　　 方法: 分離人原發(fā)性肝細胞癌標本及癌巢周圍肝組織中浸潤白細胞，使用CD45、CD3、CD4、CD8、PD-1、Ki-67、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及Perforin進行流式細胞染色，對比分析肝癌組織和癌周組織中T細胞PD-1的表達情況，并對比分析PD-1對T細胞增殖及表達IFN-γ/TNF-α及Granzyme B/Perfo

9、rin的影響。通過熒光免疫組化進一步確定PD-1的表達情況，并觀察PD-1+細胞與B7-H1+細胞在空間定位上的關系
　　 結果: 流式細胞分析及熒光免疫組織化學檢查均顯示：CD8+T細胞在肝癌及癌周組織中是主要表達PD-1的細胞，且肝癌組織中PD-1+CD8+T細胞的比例高于癌周組織。CD8+T細胞在肝癌及癌周組織中是主要表達PD-1的細胞，且肝癌組織中PD-1+CD8+T細胞的比例高于癌周組織。Ki-67是細胞增殖的標志之一

10、。癌周組織中Ki-67+CD8+T細胞的比例高于肝癌組織。重點分析肝癌組織中CD8+T細胞：PD-1+CD8+T細胞較PD-1-CD8+T細胞表達較少的Ki-67，IFN-γ/TNF-α及GranzymeB/Perforin。熒光免疫組織化學確定肝癌組織中CD8+細胞高表達PD-1，并且進一步顯示：肝癌中大多數(shù)PD-1+細胞與B7-H1+細胞位于癌巢周圍，且兩種細胞有相互聚集、相互作用的趨勢。
　　 結論: CD8+T細胞是發(fā)揮

11、抗腫瘤作用的主要細胞之一。肝癌中CD8+T細胞的PD-1表達增加，而增殖能力減弱。對比分析說明PD-1的表達與CD8+T細胞的增殖能力及功能性細胞因子或酶的表達呈負相關。PD-1 在CD8+T細胞的高表達影響其抗腫瘤能力。PD-1+細胞與B7-H1+細胞常定位于癌巢周圍，互相之間有聚集和作用的趨勢。這說明肝癌中CD8+T細胞在質（PD-1 高表達）和位（與B7-H1+有接觸趨勢）上均有與B7-H1+枯否氏細胞相互作用的優(yōu)勢。
　　

12、 第四部分：阻斷B7-H1/PD-1通路增強CD8+T細胞的抗腫瘤能力
　　 目的: 研究阻斷B7-H1/PD-1 通路在恢復CD8+T細胞抗腫瘤能力中的作用。
　　 方法: 分離肝癌組織浸潤白細胞，磁珠分選CD14+細胞及CD8+細胞。體外共培養(yǎng)CD14+細胞和CD8+細胞，利用抗人CD3和CD28 抗體刺激CD8+T細胞，根據(jù)不同分組加入抗PD-1 或抗B7-H1 阻斷性抗體，以及同型對照小鼠IgG1。共培養(yǎng)五天后

13、，使用CD5、CD8、PD-1、Ki-67、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及Perforin 進行流式細胞染色，檢測阻斷B7-H1/PD-1 通路后，T細胞增殖及抗腫瘤功能是否恢復。同時利用氚摻入增殖實驗及酶聯(lián)免疫斑點實驗（ELISPOT）分別檢測T細胞的增殖能力及腫瘤抗原特異性IFN-γ分泌能力，進一步確定阻斷B7-H1/PD-1 通路的效應。
　　 結果: 肝癌浸潤CD8+T細胞高表達PD-1，CD14+枯否

14、氏細胞高表達B7-H1。分選出肝癌組織中的CD14+細胞及CD8+細胞，共培養(yǎng)五天后，CD8+T細胞的增殖和抗腫瘤細胞因子或酶的表達明顯授抑制。通過加入抗PD-1 或抗B7-H1 阻斷性抗體可明顯促進CD8+T細胞的增殖，即Ki-67表達水平及氚摻入實驗中的CPM 值。
　　 另一方面，阻斷性治療可以恢復CD8+細胞分泌抗腫瘤細胞因子和酶的能力。同型對照抗體沒有類似效應。通過ELISPOT 進一步發(fā)現(xiàn)，抗PD-1 或抗B7-H1