MAGe-A1和MAGe-A3在腦膠質(zhì)瘤中的表達及機制.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性神經(jīng)上皮性腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的45-50％，目前腦膠質(zhì)瘤治療方法有手術治療、放療和化療，但總的治療效果仍不理想，預后差。腫瘤免疫治療是一種針對性更強、副作用更小的治療，目前，它已經(jīng)成為繼腫瘤的手術治療、放射治療及化療之后的第四種腫瘤治療模式。腫瘤免疫治療的興起使得確立免疫治療理想靶點，即，特異性腫瘤相關抗原，成為關鍵的前提，這要求腫瘤抗原具有以下特點:抗原在腫瘤中高表達，而在正常組織不表達或者表達具有

2、嚴格限制性。
　　 癌睪丸抗原(Cancer/testisantigen，CTA)在正常人體組織僅表達于睪丸生殖細胞和部分胎盤，而睪丸又被認為是免疫豁免器官，因此，CTA被看做是腫瘤特異性免疫治療的理想靶點。黑色素瘤相關抗原基因（Melanoma-associatedantigengene-A，MAGE-A）是CTA的一個亞家族。近年來，因其具有更高的腫瘤特異性而成為研究熱點。
　　 近年來，導師的課題組一直致力于MAG

3、E-A基因的研究。本次研究首先采用免疫組織化學的方法觀察了MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織的表達情況及其與膠質(zhì)瘤臨床生物學指標和預后之間的關系。應用RT-PCR方法檢測MAGE-A1、MAGE-A3在mRNA水平的表達，并通過MSP的方法分析了MAGE-A1、MAGE-A3啟動子區(qū)甲基化情況與其基因表達的關系。在細胞水平給與DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferase，DNMT

4、)抑制劑及組蛋白去乙?；福℉istonedeacetylase，HDAC）抑制劑，觀察細胞系在給藥前后MAGE-A1、MAGE-A3基因表達情況，分析表觀遺傳學機制在MAGE-A1和MAGE-A3表達中的作用。
　　 第一部分，MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及與膠質(zhì)瘤臨床生物學指標之間的關系
　　 目的:
　　 通過檢測MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11在腦膠質(zhì)瘤組織和

5、正常腦組織中的表達水平，研究三種蛋白表達與膠質(zhì)瘤臨床生物學指標和預后之間的關系。
　　 方法:
　　 應用免疫組織化學的方法檢測MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達水平，并分析三種抗原蛋白與膠質(zhì)瘤臨床生物學指標（包括患者年齡、性別、臨床病理分級、KPS評分及ki-67指數(shù)）之間的關系，且通過病例隨訪，分析MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白與腦膠質(zhì)瘤患者預

6、后之間的關系。
　　 結果:
　　 1、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在正常睪丸組織中的表達
　　 在正常睪丸組織中，MAGE-A1主要位于初級精母細胞和精原細胞的細胞漿和細胞膜;MAGE-A3和-A11主要位于睪丸組織初級精母細胞和精原細胞的細胞漿和細胞核。
　　 2、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達
　　 正常腦組織中，沒有MAGE-A1、-A3和-

7、A11蛋白的表達。MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的高表達率（指的是2+～3+）分別為64.1％、51.2％和57.6％。MAGE-A1(P=0.000)和MAGE-A11(P=0.000)蛋白的表達在低級別膠質(zhì)瘤和高級別膠質(zhì)瘤之間有顯著性差異，且隨著病理級別的升高而增加，而MAGE-A3(P=0.958)蛋白則在各病理級別間沒有顯著性差異。在高級別腦膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級），MAGE-A1蛋白主要表達于腫瘤細胞的胞漿，而MA

8、GE-A3和MAGE-A11蛋白則主要表達于膠質(zhì)瘤細胞的胞漿和胞核;在低級別腦膠質(zhì)瘤（Ⅰ～Ⅱ級），MAGE-A1蛋白主要表達于腫瘤細胞的胞漿和胞膜，而MAGE-A3和MAGE-A11蛋白則主要表達于膠質(zhì)瘤細胞的胞漿和胞核。
　　 3、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤的表達與臨床病例資料之間的關系
　　 MAGE-A1蛋白表達與患者的年齡（x2=1.651，P=0.199）、性別(x2=0.163，P=0.6

9、86)、KPS評分（x2=0.060，P=0.806）之間均無相關性，而與病理級別（x2=25.714，P=0.000）有顯著相關性，隨著病理級別的增高，MAGE-A1蛋白表達增加。
　　 MAGE-A3蛋白表達與患者的年齡（x2=0.195，P=0.658）、性別（x2=0.778，P=0.378）、病理級別(x2=0.159，P=0.690)之間均無相關性，而與KPS評分(x2=13.637，P=0.000)有顯著相關性。<

10、br>　　 MAGE-A11蛋白表達與患者的年齡（x2=0.382，P=0.537）、性別（x2=0.000，P=0.986）、KPS評分（x2=0.209，P=0.648）之間均無相關性，而與病理級別（x2=4.718，P=0.030)有顯著相關性，隨著病理級別的增高，MAGE-A11蛋白表達增加。
　　 4、MAGE-A1，-A3，-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤的表達與ki-67指數(shù)(ki-67index，ki-67LI)之間的關

11、系
　　 MAGE-A1(x2=4.965,P=0.026)和MAGE-A11蛋白(x2=7.123,P=0.008)與ki-67LI有顯著相關性，而MAGE-A3（x2=2.224，P=0.136）則與ki-67LI無顯著相關性。
　　 5、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在腦膠質(zhì)瘤的表達與臨床預后之間的關系
　　 MAGE-A1和MAGE-A11蛋白高表達組的總生存期較MAGE-A1（P=0.005）和M

12、AGE-A11（P=0.019）低表達組短，差異有顯著性;MAGE-A3（P=0.304）高表達組總生存期與低表達組無顯著性差異。log-rank單因素分析顯示，病理級別、KPS評分、年齡、ki-67LI、MAGE-A1和MAGE-A11蛋白表達水平與患者的預后相關。進一步進行Cox's回歸分析，得出病理級別、KPS評分、MAGE-A1和MAGE-A11蛋白表達水平與患者的預后相關。
　　 結論:
　　 1、MAGE-A

13、1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白具有相對的腫瘤特異性，可以作為理想的腫瘤免疫治療靶點。
　　 2、MAGE-A1和MAGE-A11可能與膠質(zhì)瘤細胞的增殖有關。
　　 3、MAGE-A1、MAGE-A11蛋白、病理級別和KPS評分可以作為判斷膠質(zhì)瘤預后的指標。
　　 第二部分，MAGE-A1和MAGE-A3在腦膠質(zhì)瘤中mRNA水平的表達及DNA甲基化狀態(tài)分析
　　 目的:
　　 檢測MAGE

14、-A1和MAGE-A3mRNA表達及MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，分析啟動子區(qū)甲基化與mRNA及蛋白表達的關系，并分析rnRNA表達及啟動子區(qū)甲基化與臨床病例特點之間的關系。
　　 方法:
　　 應用RT-PCR的方法在腦膠質(zhì)瘤組織中檢測了MAGE-A1和MAGE-A3在mRNA水平的表達，并分析它們蛋白表達及患者預后之間的關系，應用MSP技術分析MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，分

15、析兩者的mRNA、蛋白表達與啟動子區(qū)甲基化之間的關系以及MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)甲基化與臨床生物學特征之間的關系。
　　 結果:
　　 1、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA在正常腦組織及膠質(zhì)瘤組織中的表達
　　 正常腦組織中均未發(fā)現(xiàn)MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達。膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達陽性率分別為65.4％和38.5％;兩者同時表達陽性的有21例，占

16、26.9％，僅有一個表達陽性的有60例，占76.9％，兩者都不表達的為18例，占23.1％。
　　 2、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達與膠質(zhì)瘤患者生存期之間的關系
　　 MAGE-A1mRNA陽性表達組的總生存期較陰性表達組短(P=0.046)，差異有顯著性，MAGE-A3陽性表達組總生存期與陰性表達組之間無顯著性差異(P=0.797)。
　　 3、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表達與蛋白表

17、達之間的關系
　　 MAGE-A1(r=0.402,P=0.000)和MAGE-A3(r=0.242,P=0.033)的mRNA與蛋白表達之間呈正相關;但mRNA與蛋白的表達并非完全以一一對應。
　　 4、MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)去甲基化狀態(tài)
　　 MAGE-A1基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的去甲基化率分別為0％(0/15)、64.1％(50/78)，兩者之間差異有顯著性(x2=20.796，P=

18、0.000)。MAGE-A3基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的去甲基化率分別為0％(0/15)和41％(32/78)，兩者之間差異有顯著性（x2=9.382，P=0.002）
　　 5、MAGE-A1和MAGE-A3基因的去甲基化狀態(tài)與它們的基因及蛋白表達之間的關系
　　 MAGE-A1基因啟動子區(qū)去甲基化的腦膠質(zhì)瘤組織其mRNA表達水平顯著高于發(fā)生甲基化的膠質(zhì)瘤組織(0.1414±0.0690vs.0.0317±0.00

19、66，P=0.000)。MAGE-A1基因啟動子區(qū)去甲基化與其在mRNA(x2=37.289，P=0.000)水平上的表達及在蛋白(x2=14.736，P=0.000)水平上的表達均有顯著的相關性。MAGE-A3基因啟動子區(qū)去甲基化的腦膠質(zhì)瘤組織其mRNA表達水平顯著高于發(fā)生甲基化的膠質(zhì)瘤組織(0.0666±0.0065vs.0.0071±0.0026，P=0.000)。MAGE-A3基因啟動子區(qū)去甲基化與MAGE-A3mRNA水平上的

20、表達有顯著的相關性(x2=36.066，P=0.000)而與其在蛋白水平上的表達無明顯的相關性(x2=1.697，P=0.193)。但MAGE-A1和MAGE-A3基因啟動子區(qū)的去甲基化與其mRNA表達之間并非完全一一對應。
　　 6、MAGE-A1和MAGE-A3基因的去甲基化狀態(tài)與臨床生物學特征之間的關系
　　 MAGE-A1基因的去甲基化狀態(tài)與患者性別(x2=0.778，P=0.378)、KPS評分(x2=0.06

21、0，P=0.806)之間無顯著相關性，與年齡(x2=7.306，P=0.007)和病理級別(x2=14.286，P=0.003)有顯著相關性，低級別膠質(zhì)瘤MAGE-A1基因發(fā)生去甲基化頻率顯著低于高級別膠質(zhì)瘤。MAGE-A1啟動子區(qū)去甲基化組的總生存期較甲基化組短，但差異無顯著性(P=0.179)。MAGE-A3基因的去甲基化狀態(tài)與患者年齡(x2=0.1.009，P=0.315)、KPS評分(x2=0.102，P=0.749)、性別(x

22、2=0.464，P=0.496)及病理級別(x2=3.367，P=0.338)均無相關性。MAGE-A3啟動子區(qū)去甲基化組的總生存期較甲基化組短，但差異無顯著性(P=0.201)。
　　 結論:
　　 1、正常腦組織中無MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表達，而在大部分膠質(zhì)瘤組織中有兩者的表達，這表明兩者可以作為免疫治療的理想靶點。
　　 2、MAGE-A1的mRNA表達水平可以作為判斷臨床預后的一個指標。

23、
　　 3、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達水平與蛋白表達水平之間呈正相關，但蛋白與mRNA的表達并不完全對應，蛋白表達高率于mRNA表達率，考慮與抗體在不同MAGE-A家族成員之間有交叉反應所致。
　　 4、MAGE-A1和MAGE-A3基因在正常腦組織均無啟動子區(qū)去甲基化，而在大部分膠質(zhì)瘤組織存在啟動子區(qū)去甲基化。
　　 5、DNA去甲基化是MAGE-A1和MAGE-A3表達的機制之一，但是兩者表達

24、可能除此以外還有其他機制在起作用。
　　 6、MAGE-A1和MAGE-A3啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)不能作為判斷預后的指標。
　　 第三部分，MAGE-A1和MAGE-A3在腦膠質(zhì)瘤細胞株的表達及DNA甲基化和組蛋白乙酰化狀態(tài)的檢測
　　 目的:
　　 對膠質(zhì)瘤細胞系U87和U251給予DNMT抑制劑:5-aza-CdR和HDAC抑制劑:TSA單獨或聯(lián)合刺激，觀察給藥前后MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表

25、達情況，以進一步說明兩個基因表達的機制。
　　 方法:
　　 對兩種細胞分別給予5-aza-CdR濃度為0、2.5μmol/l、5μmol/l和/或TSA濃度為0、0.5μmol/l、1μmol/l藥物刺激72小時，然后，更換新鮮不含這兩種藥物的培基，培養(yǎng)48小時，收集細胞，提取RNA，以RT-PCR的方法檢測給藥刺激前后的MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達量。試驗中，我們將5-aza-CdR濃度均為0μmol/

26、l，TSA濃度分別為0、0.5、1μmol/l的細胞定為第1～3組，5-aza-CdR為2.5μmol/l，TSA濃度分別為0、0.5、1μmol/l的細胞定為第4～6組，5-aza-CdR為5μmol/l，TSA濃度分別為0、0.5、1μmol/l的細胞定為第7～9組。
　　 結果:
　　 1、MAGE-A1和MAGE-A3在U87細胞和U251細胞的表達
　　 在未給與藥物處理時，U87細胞無MAGE-A1和

27、MAGE-A3的表達，U251細胞有少量MAGE-A1（0.0553±0.001）和極少量MAGE-A3（0.0027±0.0003）表達。
　　 2、U87藥物處理后MAGE-A1和MAGE-A3的變化
　　 通過RT-PCR檢測MAGE-A1和MAGE-A3mRNA在U87的表達情況，在第1～3組中，兩個表達均為陰性，在第4～6組細胞中，兩者較第1～3組表達高，且隨著TSA濃度的增強逐漸增強，在第7～9組細胞中，兩者

28、的表達較第4～6組高，且隨著TSA濃度的增強逐漸增強。析因分析，單用5-aza-CdR、單用TSA以及聯(lián)合應用兩者后，MAGE-A1和MAGE-A3的表達之間均有顯著性差異，TSA三個不同濃度即0、0.5、1μmol/l及5-aza-CdR三個不同濃度即0、2.5、5μmol/l對兩個基因表達的影響之間均有顯著性差異，其中，5-aza-CdR濃度為5μmol/l聯(lián)合TSA濃度為1μmol/l，兩者表達量最高，這提示:在U87細胞單獨給予

29、HDAC抑制劑不能引起MAGE-A1和MAGE-A3基因的表達激活，單獨給予5-aza-CdR或與TSA合用可以引起兩個基因的表達激活，且兩者合用的作用好于單獨給藥，兩者有協(xié)同作用。
　　 3、U251藥物處理前后MAGE-A1和MAGE-A3的變化。
　　 在第1～3組，MAGE-A1和MAGE-A3均有少量表達，在第4～6組細胞中，兩者的表達較第1～3組表達量高，且隨著TSA濃度的增高逐漸增強，在第7～9組細胞中，兩

30、者的表達較第4～6組高，且隨著TSA濃度的增高逐漸增。析因分析顯示，單用5-aza-CdR、單用TSA以及聯(lián)合應用兩種藥物，兩者表達之間均有顯著性差異，其中，5-aza-CdR濃度為5μmol/l聯(lián)合TSA濃度為1μmol/l，兩者表達量最高，這提示:單獨給予HDAC抑制劑不能引起MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表達增加，單獨給予5-aza-CdR或與TSA合用可以引起MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表達增加，且兩藥合用的