磁感應(yīng)熱療及熱化療治療大鼠乳腺癌的療效及對免疫功能的影響.pdf

1、研究背景：惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類的健康，現(xiàn)有的放射治療、化學(xué)治療有較嚴(yán)重的副作用，手術(shù)會造成器官功能的損害。腫瘤熱療已成為繼手術(shù)、放療、化療和生物免疫治療之后的又一治療腫瘤的重要手段。熱療能有效殺傷惡性腫瘤細(xì)胞，延長患者的生存時間，提高患者的生活質(zhì)量，而且與放療、化療產(chǎn)生協(xié)同互補(bǔ)作用，增加患者對放療和化療的敏感性，同時又能減輕放療、化療的副作用，因而被國際醫(yī)學(xué)界稱為“綠色療法”。腫瘤的磁感應(yīng)熱療把磁熱介質(zhì)導(dǎo)入腫瘤，其能將熱能集中到腫瘤部位

2、，實(shí)現(xiàn)所謂“適形熱療”同時使正常組織免受損傷，具有升溫時間短，熱分布均勻和微創(chuàng)等特點(diǎn)。\在熱籽加溫治療中我們首次利用大鼠乳腺癌細(xì)胞株建立移植于大鼠乳腺部位的乳腺癌原位移植模型，利用此模型觀察45℃常規(guī)高溫治療與50～55℃熱切除治療對大鼠乳腺癌的殺傷效果及對免疫功能的影響。磁性介質(zhì)中磁性納米粒子可以攜帶抗癌藥物及放射性物質(zhì)，增加基因的轉(zhuǎn)染效率等實(shí)現(xiàn)腫瘤的局部熱化療、熱放療及熱療與生物免疫治療的結(jié)合。熱療能增加腫瘤細(xì)胞膜對化療藥的通透性，

3、降低耐藥性的產(chǎn)生，因而熱化療能產(chǎn)生協(xié)同增敏作用。甲氨蝶呤是葉酸類似物，通過干擾腫瘤的代謝發(fā)揮抗腫瘤作用，然而腫瘤細(xì)胞對其易產(chǎn)生耐藥性，我們在磁性納米粒子上用高分子聚乙烯亞胺修飾后，再共價結(jié)合化療藥甲氨蝶呤，該磁性納米粒子在交變磁場下產(chǎn)熱對腫瘤可以產(chǎn)生熱療作用，同時加熱促進(jìn)磁性粒子上甲氨蝶呤的釋放，促進(jìn)細(xì)胞對甲氨蝶呤的攝取，提高腫瘤治療的療效。甲氨蝶呤偶聯(lián)的磁性納米粒子粒徑約10nm，呈超順磁性。目前含甲氨蝶呤化療藥的超順磁性納米粒子熱化

4、療治療動物腫瘤實(shí)驗(yàn)還沒有開展，我們用此磁流體研究熱化療對大鼠乳腺癌的治療效果，為磁感應(yīng)熱化療的可行性提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 第一章大鼠乳腺原位移植性乳腺癌模型的建立及生物學(xué)特性
　　 目的：建立大鼠乳腺原位移植性乳腺癌模型觀察腫瘤的生物學(xué)特性。
　　 方法：分為2組：接種腫瘤觀察組大鼠40只，正常組大鼠4只。接種腫瘤觀察組在大鼠右前胸部乳腺處皮下接種Walker-256乳腺癌細(xì)胞株觀察腫瘤的生長、生存期、病理

5、學(xué)檢查及死后解剖有無臟器轉(zhuǎn)移。接種后2周及3周均隨機(jī)處死2只大鼠取腫瘤組織并觀察大鼠有無臟器轉(zhuǎn)移。正常組大鼠予處死取乳腺組織。
　　 結(jié)果：正常大鼠乳腺見較廣泛的脂肪組織分布，乳腺呈單層上皮分布，未見明顯的增生改變。接種腫瘤的乳腺組織可見腫瘤侵犯乳腺上皮后乳腺出現(xiàn)明顯的上皮增生、核異型性改變、甚至癌變。大鼠腫瘤成瘤率80％，腫瘤呈圓形或橢圓形突出于體表，生存期(37.10±8.54)天。2周處死大鼠未見臟器腫瘤轉(zhuǎn)移，3周處死大鼠

6、見肺轉(zhuǎn)移。大鼠59.3％肺轉(zhuǎn)移，12.5％肝轉(zhuǎn)移，6.25％腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，6.25％皮下轉(zhuǎn)移等，未見明顯的骨轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論：大鼠腫瘤生長相對較快，與人類常見乳腺癌不相符合，與炎性乳癌相似，可作為惡性腫瘤基礎(chǔ)研究的模型。
　　 第二章熱籽感應(yīng)加溫治療大鼠乳腺原位移植性乳腺癌及對免疫功能的影響
　　 目的：評估45℃常規(guī)熱療與50℃～55℃熱切除治療對大鼠乳腺原位移植性乳腺癌的治療效果及對免疫功能的影響。

7、>　　 方法：185只在右前胸部乳腺皮下接種Walker-256乳腺癌細(xì)胞的荷瘤Wistar大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)：C組，M組，T組，H組。H1組：45℃常規(guī)熱療，治療時間30分鐘；H2組：50℃～55℃熱切除治療，治療10分鐘。加溫治療后即刻、治療后12h及24h每組均處死2只大鼠行常規(guī)病理檢查，HSP70、Bax、Bcl-2、PCNA的免疫組化檢測和凋亡檢測。熱療后2周在C組、H1組與H2組每組處死5只大鼠檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群及

8、IL-2和IFN-γ水平。評估大鼠腫瘤體積及觀察長期生存。
　　 結(jié)果：可見腫瘤侵入乳腺組織，乳腺上皮增生、核異型性明顯甚至癌變。熱療后H1組Bax蛋白表達(dá)增加Bcl-2表達(dá)下降，腫瘤細(xì)胞大量凋亡與H2組比較差異有顯著性。H2組腫瘤細(xì)胞見大片的壞死。H1組與H2組加溫治療后即刻PCNA表達(dá)開始減弱，治療后12h及24h后只有少量殘存的腫瘤細(xì)胞表達(dá)PCNA與C、M及T組比較差異有顯著性。H1組與H2組加溫治療后即刻HSP70的表達(dá)

9、增加，治療后12h及24h后殘存的少量腫瘤細(xì)胞表達(dá)HSP70與C、M及T組比較差異有顯著性。熱療后2周腫瘤體積H1組、H2組與3個對照組比較差異有顯著性。H1組、H2組與3個對照組比較生存期明顯延長，H2組比H1組長。外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4＋在H1組、H2組比C組高，差異有顯著性，H1組比H2組高，差異有顯著性。CD4＋/CD8＋比值在H1組、H2組比C組高，差異有顯著性，H1組比H2組高，差異也有顯著性。血清IL-2水平H1組、H

10、2組比C組高，差異有顯著性。血清IFN-γ的水平H1組、H2組比C組高，差異有顯著性，H2組比H1組高，差異有顯著性。
　　 結(jié)論：45℃常規(guī)熱療與50℃～55℃熱切除治療對大鼠原位移植性乳腺癌的生長有一定的抑制作用，50℃～55℃熱切除治療大鼠的存活率高，兩組均能提高機(jī)體的免疫功能。
　　 第三章甲氨蝶呤修飾的超順磁性納米粒子熱化療治療大鼠乳腺癌及對免疫功能的影響
　　 目的：磁性納米粒子在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有較

11、廣泛的應(yīng)用，如局部腫瘤的磁感應(yīng)熱療、藥物的傳遞及核磁共振成像及基因轉(zhuǎn)染等。甲氨蝶呤是葉酸類似物，通過干擾腫瘤的代謝發(fā)揮抗腫瘤作用，然而其毒副作用大，而且腫瘤細(xì)胞對其易產(chǎn)生耐藥性，為了減少它的毒副作用，避免耐藥性的產(chǎn)生，研究者往往采用將其與一些高分子載體偶聯(lián)，然而這種方式僅能產(chǎn)生單一的化療作用。本研究采用聚乙烯亞胺修飾Fe3O4磁性納米粒子作為熱介質(zhì)，將MTX共價結(jié)合在PEI修飾的磁性納米粒子上，這樣實(shí)現(xiàn)磁感應(yīng)熱療及化療的雙重治療作用，通

12、過該磁性介質(zhì)對荷瘤大鼠治療效果的觀察及對免疫功能的影響的研究，為磁感應(yīng)熱化療的可行性提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 方法：自制PEI修飾的Fe3O4磁性納米粒子，粒子呈超順磁性，粒徑約10nm。MTX共價修飾的磁性粒子也呈超順磁性，粒徑約10nm。在大鼠右前胸部乳腺處皮下接種Walker-256乳腺癌細(xì)胞，7～10天后大鼠長出1.5～2cm的腫瘤進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，在腫瘤內(nèi)注射1/2腫瘤體積量的300mg/ml的含PEI或MTX化療藥的磁流體

13、，24h后在腫瘤周圍注射1ml的磁流體30min后進(jìn)入交變磁場中升溫治療。予磁流體體外測溫及體內(nèi)溫度監(jiān)測。分為以下十二組：47℃熱化療組：24只，含MTX的磁流體在交變磁場中升溫到47℃，治療時間30min；47℃熱療組：24只，PEI修飾的磁流體在相同磁場中升溫到47℃，治療時間30min；單次42℃熱化療組：21只，含MTX磁流體在磁場中升溫到42℃，治療時間60min；單次42℃熱療組：21只，PEI修飾的磁流體在磁場中升溫到42

14、℃，治療時間60min；多次42℃熱化療組：12只，含MTX磁流體在磁場中升溫到42℃，治療時間60min，治療間隔72h，治療2～5次；多次42℃熱療組：12只，PEI修飾的磁流體在磁場中升溫到42℃，治療時間60min，治療間隔72h，治療2～5次；磁流體化療藥物對照組：16只，注射含MTX化療藥的磁流體不進(jìn)入磁場升溫，治療后24h處死2只大鼠；空白對照組：21只，接種腫瘤大鼠不做任何處理；磁場對照組：12只，在交變磁場中輻照30m

15、in；磁流體對照組：12只，注射PEI修飾的磁流體不進(jìn)入磁場治療；MTX化療藥組：16只，在腫瘤內(nèi)注射20mg/kg的MTX化療藥，治療后24h處死2只大鼠；正常組：10只，不接種腫瘤觀察生存情況。治療后即刻除正常組、MFC、MTX組外每組處死2只行病理檢查。治療后12h47℃熱化療組、47℃熱療組、單次42℃熱化療組、單次42℃熱療組、空白對照組每組處死2只，24h每組處死3只行病理檢查、電鏡檢查、PCNA、HSP70免疫組織化學(xué)檢測

16、及血常規(guī)、生化檢查。治療后2周47TC組、47T組、單次42TC組、單次42T組、MFC、MTX、C組及正常組大鼠每組處死4只取外周血做IL-2、IFN-γ、IL-4免疫功能檢測和血常規(guī)、生化檢查，其余大鼠觀察生存情況。
　　 結(jié)果：磁流體升溫較好，治療后腫瘤組織內(nèi)見大量的磁性納米粒子分布，熱化療及熱療組腫瘤組織出現(xiàn)凋亡、壞死改變，以47℃治療組明顯。治療后24hHSP70、PCNA的表達(dá)在47TC及47T組明顯降低與單次42T

17、C、單次42T、MFC、MTX、C組比較有顯著性差異。治療后腫瘤體積47TC組、47T組、多次42T組與單次42TC、單次42T、MFC、M、MF、MTX、C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，多次42TC組與單次42T、MFC、M、MF、MTX、C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。長期生存觀察除正常組外，47TC組、47T組、多次42TC組、多次42T組與C、M、MF、MTX組比較差異有顯著性，47℃熱化療組存活率84.6％。47TC及47T組外周血血清I

18、L-2水平比單次42T及C組高，差異有顯著性，與正常組比較無顯著性差異。IFN-γ水平在47TC組、47T組、單次42TC組比C組高，差異有顯著性。IL-4水平在各組比C組低，差異有顯著性。磁流體熱化療后24h白細(xì)胞降低，部分大鼠轉(zhuǎn)氨酶升高。治療后2周血象及肝、腎功能無明顯異常。
　　 結(jié)論：熱化療可能比單純的熱療及化療療效好，47℃熱化療存活率最高。47℃熱化療/熱療與多次42℃熱化療、多次42℃熱療一定程度上抑制了腫瘤的生長