CD133+造血祖細胞對大腸癌細胞生物學特性的影響與探討.pdf

1、研究背景和目的:
　　 大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一。近年來，由于生活飲食習慣改變的原因，我國大腸癌的發(fā)病率和死亡率不斷呈逐漸上升趨勢，而侵襲和轉移是導致患者死亡的主要原因。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多步驟、多基因共同作用的復雜過程。腫瘤細胞和宿主之間的相互作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在因素，腫瘤細胞轉移具有一定的器官傾向性，這可能是瘤細胞與特定的器官微環(huán)境相互作用相互選擇的結果

2、。腫瘤轉移取決于腫瘤細胞本身的分子特性和其分泌的因子對周圍間質細胞的影響，包括血管、結締組織和免疫細胞等。特殊的腫瘤微環(huán)境通過各種調(diào)節(jié)機制影響著腫瘤細胞的生長發(fā)展和侵襲轉移。因此，腫瘤轉移不只是腫瘤細胞本身的生物學特性及遺傳特性所決定，從根本上說是癌細胞與宿主相互作用的結果，宿主甚至起決定性作用。
　　 造血祖細胞(hematopoietic progenitor cell)是造血組織具有自我復制和分化潛能的原始細胞。最初CD3

3、4+抗原被認為是造血祖細胞的重要標志，該抗原在原始造血細胞表達旺盛，后隨細胞分化而逐漸減弱。對祖細胞表面標志性抗原的初步研究發(fā)現(xiàn)，CD133+細胞較CD34+細胞具有更強的增殖潛能且包含有更高比例的長期培養(yǎng)起始細胞，在正常骨髓微環(huán)境條件下CD133+細胞可能比CD34+細胞具有更強的趨化和遷移能力，CD133+造血祖細胞可能代表了更原始的造血細胞。
　　 Kaplan RN發(fā)現(xiàn)了VEGFR1陽性造血祖細胞(vascular en

4、dothelial growthfactor receptor1 positive hematopoietic progenitor cell，VEGFR1+HPC)在動物腫瘤轉移中起到?jīng)Q定的作用，VEGFR1+HPC并非以前發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)即VEGFR2陽性造血祖細胞，而是同時具備CD133和VEGFR1兩種標記的一種造血祖細胞，因為腹腔注射VEGFR2抗體，不能阻

5、斷VEGFR1+HPC細胞簇形成及瘤轉移灶形成，只能限制腫瘤轉移灶生長。利用β半乳糖苷酶標記骨髓細胞移植的小鼠Lewis肺癌模型、小鼠B16黑色素瘤模型和c-myc轉基因小鼠自發(fā)性淋巴瘤模型發(fā)現(xiàn):VEGFR1+HPC首先在特定器官形成細胞簇(VEGFR1+HPC cellular clusters)，為瘤細胞準備了易于形成轉移的微環(huán)境，這些細胞簇形成部位與腫瘤轉移常見部位一致。腫瘤轉移到某種特定器官的細胞和分子機制還不是很清楚，但是很多

6、腫瘤都有轉移到某一特定器官的傾向。依靠腫瘤轉移相關細胞標簽—VEGFR1+造血祖細胞在靶器官形成轉移的微環(huán)境，促進了腫瘤的侵襲和轉移。但目前的研究均采用動物受致死性輻射后進行骨髓移植的研究方法，各器官存在輻射損傷后可能會造成非特異性骨髓動員及骨髓來源細胞的聚集，且尚未在人癌實驗層次獲得證實。
　　 臍帶血，是指胎兒出生后，殘留在臍帶和胎盤絨毛血管內(nèi)的血液。在胚胎發(fā)生過程中，32周胎齡前的胎兒循環(huán)中含有豐富的造血祖細胞，至34周齡

7、時大部分的已完成遷移，但在出生前胎兒的血循環(huán)中仍含有較多的造血祖細胞成分，只出生數(shù)月后才降至成人外周血水平，臍血中的造血祖細胞的抗原性較弱，移植相關的并發(fā)癥的發(fā)生率較骨髓和外周血少，且癥狀輕，采集保存容易，對供者無任何傷害，因此被認為是極具潛力的新的造血祖細胞來源人CD133高親和肽TR-7是本課題組前期在篩選出鼠高親和肽的基礎上篩選出來的，經(jīng)證實能與人細胞上的CD133特異結合。
　　 本研究重點探討
　　 1， CD

8、133+造血祖細胞對結直腸癌增殖、侵襲及轉移的影響，闡明CD133+造血祖細胞在結直腸癌轉移中的主要生物學功能以及大腸癌動員CD133+造血祖細胞進入血液循環(huán)進而進入轉移灶的原理，為揭示結直腸癌轉移機制及抗轉移治療奠定基礎。
　　 2，人CD133高親和肽TR-7，CD133+造血祖細胞與大腸癌細胞共培養(yǎng)，以檢測人CD133高親和肽對CD133+造血祖細胞的體外的拮抗的生物學效應利用CD133高親和肽與人腫瘤細胞共培養(yǎng)的方式分別

9、對其增殖、粘附及體外運動能力進行檢測。
　　 方法
　　 1.CD133+造血祖細胞的篩選、鑒定及培養(yǎng)
　　 取自南方醫(yī)院產(chǎn)科新生胎兒新鮮臍血標本20例，抗凝保存，并均在臍血采集后2小時內(nèi)，采用人淋巴細胞分離法，分離取出單個核細胞，再利用CD133+免疫磁珠分離法，分離出CD133+造血祖細胞，并分別予流式細胞儀及免疫細胞染色分析和鑒定樣本量中CD133+細胞含量，同時在減少誘導CD133+分化的同時，培養(yǎng)CD1

10、33+造血祖細胞。
　　 2.CD133+造血祖細胞對結直腸癌細胞生物學特性的影響
　　 將CD133+造血祖細胞與SW480共趨化培養(yǎng)，用MTT法檢測腫瘤細胞的增殖及黏附能力的影響，用Transwell小室法檢測腫瘤細胞的遷移能力的變化。觀察CD133+造血祖細胞作用前后細胞增殖、體外侵襲變化
　　 3.CD133高親和肽對CD133+造血祖細胞作用的拮抗，在上一步的試驗中，加入CD133高親和肽利用平板克隆形

11、成實驗檢測CD133高親和結合肽對大腸癌細胞體外增殖能力的影響;應用細胞粘附實驗測定細胞在纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)上的粘附性、應用運動小室實驗、細胞劃痕實驗檢測該短肽對大腸癌細胞運動遷移能力的影響。利用One-Way ANOVA檢驗對平板克隆形成實驗、細胞粘附實驗、細胞運動實驗的數(shù)據(jù)進行處理與分析，應用LSD、Dunnett，s T3多重比較來進一步比較分析
　　 結果
　　 1、CD133+造血祖細

12、胞的篩選、鑒定及培養(yǎng)
　　 由取自南方醫(yī)院產(chǎn)科，臍血標本共20份（其中18份成功提取新鮮細胞，2份失敗），50～80 ml/份，5％枸櫞酸抗凝，新鮮臍血采集后2h內(nèi)，分離出CD133+造血祖細胞。從新鮮的臍血中得到的單個核細胞數(shù)平均為（1.43±0.17）×107/ml，經(jīng)CD133磁珠分離系統(tǒng)分離得CD133+富集細胞的平均數(shù)為（1.32±0.01）×105/ml，新鮮臍血單個核細胞中的CD133+細胞所占比例為（0.8±0.

13、01）％，經(jīng)流式細胞儀鑒定CD133+CD34+細胞純度達到80％以上。CD133+細胞培養(yǎng)一周后，免疫細胞化學染色CD133，顯微鏡下觀察CD133陽性細胞數(shù)＞90％。
　　 2、CD133+造血祖細胞對結直腸癌細胞生物學特性的影響
　　 CD133+造血祖細胞能顯著促進SW480細胞的生長(n=60、Z=-6.106、P=0.000)，能促進腫瘤細胞的形態(tài)學改變，即腫瘤細胞的核深染，異型明顯，細胞呈多角形或不規(guī)則形，

14、能顯著促進SW480細胞的遷移能力;細胞黏附實驗表明，含有CD133+造血祖細胞的實驗組其腫瘤細胞的黏附能力明顯高于對照組(n=60、Z=-3.679，P=0.000)。利用丙酮沉淀法提取細胞總蛋白（即濃縮蛋白）檢測MMP-2、VEGFR-1及E-Cadherin蛋白表達情況發(fā)現(xiàn)實驗組中的3種蛋白表達水平均高于對照組。
　　 3、不同濃度的TR-7短肽對共培養(yǎng)的各組大腸癌HT-29細胞增殖能力沒有明顯作用，增殖能力差異沒有統(tǒng)計學

15、意義（F=1.473，P=0.347）。而且各組腫瘤細胞的克隆形成率實驗結果表明四組細胞增殖能力的差異有統(tǒng)計學意義(F=0.174，P=0.000)。通過對粘附能力的檢測，不同濃度TR-7對SW480、SW620細胞粘附能力影響的差異沒有統(tǒng)計學意義（Fht-29=0.428，Pht-29=0.738;Fsw620=3.109，Psw620=0.089）。Transwell細胞運動實驗顯示不同濃度梯度TR-7共培養(yǎng)后的SW480、SW62

16、0、Lovo細胞，穿過膜的細胞數(shù)顯著減少，不同濃度組間具有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學意義。并且TR-7濃度越大穿膜的細胞數(shù)越少，對細胞運動能力的影響越明顯。細胞劃痕實驗進一步證實隨著TR-7短肽濃度的增加，lovo細胞劃痕部位遷移的細胞數(shù)越少。
　　 結論
　　 1、CD133+造血祖細胞可顯著促進人結直腸癌細胞的增殖及侵襲能力，CD133+造血祖細胞與人結直腸癌細胞裸鼠共移植具有促轉移作用，初步證明，人造血祖細胞可能對人