Na+，K+-ATP酶在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25的運動神經(jīng)元樣細胞中的作用.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種特異性累及運動神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病，可累及皮質(zhì)、脊髓、腦干、脊髓束的運動神經(jīng)元。在所有ALS患者中，90％為散發(fā)病例，其余10％為家族型。已有研究提出ALS病因可能與編碼TDP-43的基因突變有關(guān)，且突變率隨著年齡增長而增加，表明其它基因或環(huán)境因素可能會促進疾病的發(fā)展。
　　TDP-43是由TARDBP基因編碼的多功能DNA-RNA結(jié)合蛋白，正常情況下只存在于細胞核內(nèi)。在ALS和FTLD-U患者腦組織

2、中，發(fā)現(xiàn)病理性TDP-43異常移位到細胞質(zhì)并在此聚集，可形成不溶性的泛素化包涵體。病理性TDP-43可經(jīng)蛋白酶水解裂開，形成分子量為25kDa的C末端片段，即TDP-25，仍具備易聚集性和細胞毒性。許多研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43和TDP-25是許多神經(jīng)變性疾病的顯著病理學特征，例如FTLD-TDP和肌萎縮側(cè)索硬化。ALS患者腦組織中TDP-25的產(chǎn)生和聚集，可能是神經(jīng)元變性的重要原因。盡管推測TDP-25在神經(jīng)元變性中起重要作用，但目前對此

3、肽鏈的作用還不十分明確。Na+，K+-ATP酶是細胞生存的核心，對維持神經(jīng)元細胞內(nèi)外離子穩(wěn)態(tài)、膜電位離子平衡及細胞的細胞膜興奮性等許多生理過程具有重要的作用。當Na+，K+-ATP酶功能受到抑制時，Na+向胞外轉(zhuǎn)運減少并在細胞內(nèi)大量聚集，通過Na+/Ca2+交換體逆向轉(zhuǎn)運，導致細胞內(nèi)Ca2+升高，引起細胞的損傷乃至凋亡。Na+，K+-ATP酶在神經(jīng)元中可表達α1、α3兩種不同亞型的亞基，根據(jù)對哇巴因親和力的不同，分為低親和力結(jié)合亞基和高

4、親和結(jié)合亞基，在不同組織和不同發(fā)育階段，不同亞型的α亞基發(fā)揮不同的作用。
　　已有證據(jù)表明ALS患者在發(fā)病早期還未出現(xiàn)臨床表現(xiàn)時，就已出現(xiàn)皮質(zhì)或脊髓運動神經(jīng)元興奮性異常增高。動物實驗證實，轉(zhuǎn)染突變SOD1基因的ALS小鼠在出現(xiàn)臨床癥狀前就已出現(xiàn)脊髓運動神經(jīng)元興奮性升高。而SOD1作為第一個被發(fā)現(xiàn)的可引起ALS的突變基因，其活性的缺失被認為是ALS的致病機理之一。神經(jīng)元興奮性增高可增加ATP的消耗，加重線粒體負擔，促進臨床癥狀的進展

5、。不僅如此，在ALS小鼠脊髓神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，細胞膜上Na+，K+-ATP酶活性明顯減低。而目前關(guān)于Na+，K+-ATP酶在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25運動神經(jīng)元樣細胞中活性特征的研究較少。
　　目的:分別檢測穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)染TDP-25蛋白和空質(zhì)粒的運動神經(jīng)元樣細胞的Na+，K+-ATP酶活性，并比較兩種細胞間是否存在差別，以探究TDP-25細胞興奮性水平的變化;驗證Na+，K+-ATP酶是否存在兩種不同的亞基及其在TDP-25細胞中的變化;分

6、析TDP-25蛋白在ALS發(fā)病機制中的作用。
　　方法:本實驗選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vector（空質(zhì)粒）、TDP-25兩種NSC34細胞系，空質(zhì)粒細胞系作為正常對照。這兩種細胞系由本實驗室構(gòu)建，采用脂質(zhì)體將TDP-25基因轉(zhuǎn)染到NSC34細胞。參考NSC34細胞系的方法對其進行培養(yǎng)，通過篩選、免疫組化技術(shù)鑒定等方法，將單克隆細胞系進行培養(yǎng)、傳代。運用全細胞膜片鉗技術(shù)，記錄兩種細胞在靜息狀態(tài)下和給予10-9、10-8、10-7、

7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L濃度梯度哇巴因灌流液后Na+，K+-ATP酶活性被抑制后的膜電流，通過統(tǒng)計作圖比較，檢測其Na+，K+-ATP酶活性以及不同亞基的特性。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染TDP-25基因的細胞（TDP-25組）和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞（Empty組）酶電流的比較。將給予不同濃度哇巴因的灌流液前后所記錄的膜電流經(jīng)統(tǒng)計后結(jié)果如下，TDP-25組:10-9mol/L(n=6):0.10538±0.07058,10

8、-8mol/L(n=6):0.10122±0.07452,10-7mol/L(n=6):0.23377±0.0683,10-6mol/L(n=6):0.48538±0.1471,10-5mol/L(n=6):0.47068±0.08315,10-4mol/L(n=6):0.64007±0.04886Empty組:10-9mol/L(n=9):0.10662±0.08123,10-8mol/L(n=6):0.15378±0.04578,1

9、0-7mol/L(n=7):0.32086±0.09789,10-6mol/L(n=6):0.28407±0.12265,10-5mol/L(n=7):0.60686±0.11757,10-4mol/L(n=8):0.69882±0.1077將TDP-25組和E組結(jié)果分別進行非線性指數(shù)擬合，得出雙指數(shù)擬合圖形及方程，擬合方程為:IP=fh×k[Oua]K-high/[Oua]+K-high+fl×k[Oua]K-low/[Oua]+K-

10、low其中，IP代表Na+，K+-ATP酶電流，k代表當高親和力或低親和力結(jié)合位點與Oua結(jié)合時一個Na+，K+-ATP酶分子產(chǎn)生的電流，K-high代表高親和力Na+，K+-ATP酶抑制性O(shè)ua結(jié)合位點的解離系數(shù)，K-low代表低親和力Na+，K+-ATP酶抑制性O(shè)ua結(jié)合位點的解離系數(shù)，fh代表高親和力Na+，K+-ATP酶占總Na+，K+-ATP酶電流的百分比，fl代表低親和力Na+，K+-ATP酶占總Na+，K+-ATP酶電流的

11、百分比，[Oua]代表Ouabain的濃度。
　　根據(jù)K-high和K-low的不同，將Na+，K+-ATP酶分為高親和力和低親和力兩種。
　　擬合結(jié)果如下:
　　Empty組:高、低親和力Na+，K+-ATP酶的Oua抑制性結(jié)合位點解離系數(shù)分別為58.79 nmol/L和197.67μmol/L，二者占總Na+，K+-ATP酶電流的百分比分別為21.8％和78.2％.
　　TDP25組:高、低親和力Na+，K+