隨機siRNA文庫的構建及其在基因組范圍內高通量篩選胃癌表柔比星耐藥相關基因中的應用.pdf

1、胃癌是我國常見的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率都很高。ECF方案(表柔比星、順鉑和5-氟尿嘧啶)是治療胃癌的標準化療方案之一。但是多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)的出現(xiàn),往往使胃癌化療失敗。順鉑和5-氟尿嘧啶的耐藥機制已經有很多的報道,但是關于胃癌表柔比星耐藥相關分子目前還知之甚少。
　　本實驗室在建立了胃癌MDR細胞亞系的基礎上,應用抑制消減雜交和差異顯示PCR等基于基因型的篩選方法,成功篩選出了一些MD

2、R相關基因。但是胃癌耐藥的機制很復雜,應用這種基于基因型的篩選方法獲得的基因仍然很難完全闡明耐藥發(fā)生的機制,而且這些分子與耐藥的發(fā)生是因果關系、果因關系或僅為伴隨現(xiàn)象很難確定。簡約化原則是生物體生物學功能完成過程中的統(tǒng)一原則,理論上耐藥的發(fā)生不可能是大量的、無規(guī)則的細胞事件,而應是在一定規(guī)律調控下的有序過程,換言之,耐藥發(fā)生的調控應是受數(shù)個關鍵分子調控的結果。
　　因此,以功能為基礎,采用基于表型的高通量篩選方法來獲得耐藥相關的重

3、要基因,探索眾多分子之間點與點、面與面、立體的網(wǎng)絡調控作用,來闡明耐藥發(fā)生的分子機制和調控網(wǎng)絡就顯得十分重要。雙鏈小干擾RNA(siRNA)可以在多種類型的細胞中介導特異性的基因沉默作用,這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為深入研究單個基因的功能提供了重要的方法學基礎,從而得到了廣泛的應用。最近的文獻報道了全基因組siRNA文庫的建立,為高通量基因功能分析和研究提供了新的方法,成為新的研究熱點。siRNA文庫可以用來篩選和研究介導復雜細胞表型和生物學過程的

4、關鍵基因,通過建立一系列具有目的表型的細胞系,有可能對特定細胞信號調節(jié)通路進行更為全面的解析。
　　因此,我們認為利用siRNA文庫的篩選方法可以篩選出表達水平被特異siRNA下調后引起胃癌單藥甚至是多藥耐藥的基因。siRNA文庫為胃癌耐藥的研究提供了新的手段,為全面理解腫瘤耐藥的機制帶來了新的契機。新的胃癌多藥耐藥基因的發(fā)現(xiàn)和研究,將為胃癌的治療提供新的靶點。表柔比星是最常用的胃癌標準化治療方案ECF的組成藥物之一,對表柔比星耐

5、藥相關基因進行篩選和研究,相對來說更為貼近臨床。本課題將對此進行探討。
　　【目的】：1、構建部分隨機siRNA逆轉錄病毒文庫;2、在胃癌細胞系SGC7901中篩選胃癌表柔比星耐藥相關基因;3、探討候選靶基因在胃癌耐藥中的作用及其可能的分子機制。
　　【方法】：1、利用分子克隆技術構建小干擾RNA逆轉錄病毒表達載體,采用Western Blot、MTT和熒光顯微鏡觀察對其功能進行驗證。2、按照文獻報道的設計有效siRNA的法

6、則,合成部分隨機的siRNA庫引物以及短片段的延伸引物,通過大規(guī)模的退火、第二鏈延伸、酶切、純化、連接以及轉化等步驟建立部分隨機的siRNA質粒文庫,并包裝為逆轉錄病毒。3、將此病毒文庫感染胃癌細胞SGC7901,加入表柔比星進行篩選。然后收集存活細胞,提取基因組DNA,通過PCR釣取功能siRNA分子,通過生物信息學分析獲得胃癌耐藥的相關基因。4、通過Realtime RT-PCR、Western Blot、MTT、流式細胞術等方法對

7、候選基因進行功能驗證,并探討其介導胃癌耐藥的可能機制。
　　【結果】：1、成功構建了siRNA逆轉錄病毒表達載體我們將逆轉錄病毒表達載體PBMN-Z和逆轉錄病毒嵌合表達載體PBMN-GFP分別雙酶切后進行連接,構建出新的逆轉錄病毒表達載體pRetroGFP,使其不但具有逆轉錄病毒的表達元件,而且可以表達綠色熒光蛋白GFP,以便于后續(xù)的篩選和監(jiān)測工作。同時,我們將促細胞周期進展分子Cdc2 siRNA的特異性寡核苷酸克隆到siRNA

8、表達載體Phippy中,構建成pHippy-Cdc2,然后通PCR的方法擴增出Cdc2的序列和siRNA的表達圖框,最后和pRetroGFP連接,構建成新的小干擾RNA逆轉錄表達載體psiRNA-Cdc2。因此,我們構建好的siRNA逆轉錄病毒表達載體來源于三個不同的載體:PBMN-Z、PBMN-GFP和Phippy。為了提高逆轉錄病毒的感染效率,我們將Ecotropic receptor轉染SGC7901細胞,建立穩(wěn)定轉染的細胞系SG

9、C7901-rec。然后,將psiRNA-lib-Cdc2和psiRNA-lib-cont分別轉染包裝細胞PhoenixTM Eco,包裝為逆轉錄病毒。將病毒分別感染SGC7901-rec細胞,并分別命名為SGC7901/siCdc2和SGC7901/cont細胞系。接著我們驗證了構建的siRNA逆轉錄病毒表達載體的有效性。病毒感染后48小時,我們利用Western blot檢測了Cdc2分子的表達,結果提示,Cdc2在SGC7901/

10、siCdc2中的表達較對照細胞SGC7901/cont顯著下調。MTT實驗也證實,SGC7901/siCdc2較對照細胞SGC7901/cont的生長速度明顯減慢。感染后72小時對兩種細胞進行熒光顯微鏡觀察,根據(jù)綠色熒光蛋白GFP的表達情況,病毒的感染效率約為20％,同時,通過光學顯微鏡下的細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn),SGC7901/siCdc2較SGC7901/cont的細胞數(shù)目顯著減少,增殖顯著減慢。2、隨機siRNA逆轉錄病毒文庫的構建首先進行

11、了小片段雙鏈DNA的制備:按照文獻報道的設計有效siRNA的法則,合成部分隨機siRNA庫引物和小片段延伸引物,并進行引物的退火。我們發(fā)現(xiàn)退火產物直接加入Klenow進行延伸,效率高于Qiagen Nucleotide removal kit純化退貨產物后再進行延伸。通過比較發(fā)現(xiàn),Klenow和PCR的延伸效果類似,以PCR法略優(yōu),因此本研究將采用PCR法進行引物的延伸。庫引物和延伸引物的摩爾比為1:10左右的時候延伸效率最高。檢測發(fā)現(xiàn)

12、50μl的PCR反應體系中,2μl的Taq酶較5μl的Taq酶的延伸效果好。PCR延伸后的DNA雙鏈片段大小為55bp。經Sal ?和Cla ?酶切后的雙鏈小片段即為目的小片段,由Qiagen Nucleotide removal kit純化,該試劑盒的小片段回收效率為40％。質粒psiRNA-lib-Cdc2也進行Sal ?和Cla ?雙酶切。為了防止雙酶切后的大片段和原載體不易區(qū)分,我們將酶切產物和另外一個較大片段進行連接后再進行雙

13、酶切。Sal ?和Cla ?雙酶切的產物經過定量為50ng/μl。載體和片段制備成功后,進行預連接。我們發(fā)現(xiàn),當載體和片段的比例為1:10的時候連接效率最高,50ng的載體在10cm的平皿約轉化出8×103個克隆,50ng的自連載體在10cm的平皿約轉化出50個克隆。最后進行大規(guī)模的連接,總共連接500個10cm的平皿,構建了庫容為4×106的隨機siRNA質粒文庫。文庫的構建重復了8次。文庫構建完畢后,我們隨機挑取96個克隆,進行Ec

14、oR ?酶切鑒定,有效克隆數(shù)為91％。隨機挑取20個克隆進行測序,除了一個克隆沒有片段插入,一個克隆出現(xiàn)TTTTT的終止信號,其余18個克隆均正確的插入了序列唯一的siRNA片段,平均GC含量為41.1％。3、利用隨機siRNA逆轉錄病毒文庫篩選胃癌表柔比星耐藥相關基因48μg的隨機siRNA質粒文庫轉染包裝細胞后包裝為逆轉錄病毒,感染SGC7901-rec細胞,加入表柔比星進行篩選。感染后2周出現(xiàn)第一批耐表柔比星的存活克隆。文庫的篩選

15、共持續(xù)了8周。在整個篩選過程中,文庫組和對照組完全平行操作。對照組篩選后沒有存活克隆出現(xiàn)。以上的文庫篩選過程共重復了8次。將文庫組篩選后存活的細胞提取基因組DNA,利用siRNA表達框兩端的引物序列進行PCR擴增,測序后,共獲得12個siRNA分子。MTT檢測顯示這12條siRNA分子的轉染都可以不同程度的降低SGC7901-rec細胞對表柔比星的敏感性,其中siRNA001和siRNA003最為顯著。siRNA001轉染細胞的IC50

16、是對照細胞的4.3倍,而siRNA003轉染細胞的IC50是對照細胞的3.9倍,提示siRNA001和siRNA003可能參與了胃癌細胞對表柔比星的耐藥。經BlAST分析,siRNA001和siRNA003分別和人類GAS1基因(growth arrest-specific 1)和PTEN基因(phosphatase and tensin homolog)的靶mRNA序列有很高的同源性。而其它10個siRNA分子沒有找到對應的靶基因。s

17、iRNA001的正義鏈(TTCATTTCCATGAAGCCACCG)和GAS1基因(NM002048.1) mRNA序列的204-224位點(TTCATTTCCAGGAAGCCACCG)有95％的同源性,其中有一個堿基不匹配(11位為T,而不是G)。siRNA003的正義鏈(TTTAACTGTATTATTTGGCAG)和PTEN基因(NM000314.4) mRNA序列的5221-5241位點(TTTAACTGTAGTATTTGGCAG

18、)有95％的同源性,其中有一個堿基不匹配(11位為T,而不是G)。Real-time RT-PCR和western blot的檢測證實, GAS1在SGC7901/siGAS1(轉染了完全匹配的GAS1 siRNA)和SGC7901/ siGAS1 (+)(轉染了有一個堿基突變的GAS1 siRNA)細胞系中的表達顯著下調,較對照細胞系SGC7901/cont降低80％以上。提示我們篩選出來的有一個堿基突變的siRNA分子可以和完全匹配

19、的siRNA分子一樣可以顯著的抑制細胞中GAS1的表達。MTT實驗證實下調GAS1的表達可以顯著降低SGC7901細胞對表柔比星的敏感性。PTEN的研究結果和GAS1相似。4、GAS1的表達下調促進胃癌多藥耐藥的發(fā)生我們利用Western Blot檢測了不同胃癌細胞系(SGC7901、MKN45、AGS和MKN28)中GAS1的表達,結果發(fā)現(xiàn)GAS1在AGS和MKN28細胞系中的表達較低,因此我們選取這兩種細胞來上調GAS1的表達。

20、r>　　【結論】：我們首次構建了一個部分隨機的siRNA逆轉錄病毒文庫，并利用這一高通量篩選技術，對胃癌表柔比星耐藥相關基因進行了表型為基礎的功能篩選。通過篩選，我們發(fā)現(xiàn)了一個新的胃癌表柔比星耐藥相關基因GAS1，GAS1基因的表達下調可以促進胃癌細胞對表柔比星的耐藥，甚至是多藥耐藥（具體一點）。我們同時對其介導耐藥的可能機制進行了探討（具體一點）。該文庫為胃癌耐藥的研究提供了新的手段，為全面理解腫瘤耐藥的機制帶來了新的契機。新的胃癌多