不結(jié)球白菜GLDH基因cDNA全長的克隆.pdf

1、L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯脫氫酶(EC 1.3.2.3.GLDH)是催化植物體內(nèi)抗壞血酸生物合成最后一步的關(guān)鍵酶。本研究克隆了不結(jié)球白菜的GLDH基因eDNA，為利用基因工程提高抗壞血酸含量，增加不結(jié)球白菜的營養(yǎng)價值，提高其對氧化脅迫的逆境適應(yīng)能力奠定基礎(chǔ)。 1.以不結(jié)球白菜常規(guī)品種蘇州青和烏塌菜為材料，進(jìn)行光及黑暗對照處理，研究GLDH活性和維生素C含量的日變化規(guī)律。結(jié)果表明：隨著光照時數(shù)的增加，不結(jié)球白菜還原型抗壞血酸含量和

2、抗壞血酸總含量增加，GLDH活性的變化趨勢與還原型抗壞血酸含量的變化趨勢相似；黑暗對照處理的GLDH活性和維生素C含量變化趨勢與光處理的不同；不結(jié)球白菜GLDH活性可能受光誘導(dǎo)調(diào)控。 2.根據(jù)花椰菜L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯脫氫酶基因的eDNA序列設(shè)計特異引物，利用RT-PCR技術(shù)從不結(jié)球白菜品種蘇州青中獲得了1779bp的GLDH cDNA片段。根據(jù)已知的片段序列設(shè)計引物，利用3’RACE和5’RACE技術(shù)，獲得了蘇州青GED

3、H基因5’端453bp以及3’端622bp。通過拼接實驗獲得的不結(jié)球白菜GLDH因cDNA全長2034bp，該基因在GenBank中登錄號為AY899298。序列分析表日月，該基因cDNA包含一完整開放閱讀框，編碼601個氨基酸。啟始密碼子ATG的-3位為A，而且其上游13-15bp有一同框架的終止密碼子(TGA)，在3’poly(A)<'+>區(qū)之前25bp有一AATAAA信號，這些都符合有效翻譯的基因全長cDNA的特征。該基因含有24

4、bp的5’非編碼區(qū)和203bp的3’非編碼區(qū)，推測的GLDH分子量為67，921 Da，等電點(diǎn)為8.66。不結(jié)球白菜GLDH氨基酸序列與花椰菜GLDH基因具有97％的同源性，與擬南芥GLDH基因具有89％的同源性，與老鼠的L-古洛糖酸-γ．內(nèi)酯氧化酶和酵母的L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶氨基酸序列的同源性分別為27.68％和23.66％。不結(jié)球白菜GLDHN端114-249是保守的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PSORT程序預(yù)測

5、不結(jié)球白菜GLDH位于線粒體內(nèi)膜上，這與前人的報道一致。 3.以蘇州青為材料提取基因組DNA，以DNA為模板進(jìn)行特異引物的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測序、酶切位點(diǎn)分析后用作Southem雜交的探針。用限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、EcoRV、KpnI、XbaI等消化基因組DNA，0.7％瓊脂糖凝膠電泳后利用向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上。地高辛標(biāo)記探針，在雜交爐中雜交。EcoRI、EcoRV和XbaI酶切