肺癌細(xì)胞中NGAL基因的基礎(chǔ)表達(dá)調(diào)控機(jī)制.pdf

1、NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物是1993年是由Kjeldsen等人在中性粒細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)的。有關(guān)NGAL基因在各種組織中的表達(dá)及其生物學(xué)功能一度成為人們研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明,NGAL基因在腫瘤組織中不僅呈現(xiàn)高表達(dá),而且還參與癌細(xì)胞的侵襲與不良分化。但是關(guān)于NGAL基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前尚不甚明了。針對(duì)于此,我們?cè)诜伟┘?xì)胞系中深入研究了NG

2、AL基因的基礎(chǔ)表達(dá)調(diào)控機(jī)制。這將有助于從分子水平上促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究;同時(shí)也會(huì)對(duì)研究NGAL基因在其它腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有指導(dǎo)意義。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　1.運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)肺腺癌、鱗癌、肺泡癌等23例肺癌組織切片中NGAL基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　2.利用RT-PCR和免疫熒光的方法,分別在RNA和蛋白水平檢測(cè)NGAL基因在肺癌細(xì)胞系95D和A549細(xì)胞中的表達(dá)情況。
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3、.運(yùn)用PCR缺失、突變及定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建一系列NGAL基因的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,然后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,檢測(cè)在關(guān)鍵調(diào)控元件缺失或突變之后的相對(duì)熒光素酶活力,確定NGAL基因的核心啟動(dòng)子區(qū)。
　　4.應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)與NGAL基因核心啟動(dòng)子區(qū)相互作用的潛在的轉(zhuǎn)錄因子。
　　5.運(yùn)用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)NGAL基因的潛在的轉(zhuǎn)錄因子在上述兩種肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
　　6.設(shè)計(jì)、合成寡核苷酸探針,利用凝膠滯留技術(shù)研究確

4、定 NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件與肺癌細(xì)胞核蛋白的結(jié)合情況;利用凝膠超滯留技術(shù)研究確定肺癌細(xì)胞中與 NGAL基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件具有結(jié)合能力的轉(zhuǎn)錄因子。
　　研究結(jié)果:
　　1.免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明,肺癌組織中NGAL陽(yáng)性著色的比例為82.61％(19/23)。肺腺癌、鱗癌組織細(xì)胞中可見NGAL中等強(qiáng)度的陽(yáng)性著色分布于整個(gè)細(xì)胞胞漿。提示在肺癌組織中有NGAL基因的顯著表達(dá)。
　　2.RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在肺

5、癌細(xì)胞系95D和A549細(xì)胞中存在著NGAL基因的表達(dá)。
　　3.構(gòu)建了一系列的NGAL基因的報(bào)告基因表達(dá)載體。檢測(cè)結(jié)果表明,NGAL基因在肺癌細(xì)胞系中的核心啟動(dòng)子區(qū)為-152~-141,而-106~-79區(qū)間是NGAL基因的最小功能啟動(dòng)子區(qū)。
　　4.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示,與NGAL基因-152~-141區(qū)段相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子可能是C/EBPs(CCAAT/enhancer binding proteins)家族成員;而與NG

6、AL基因-106~-79區(qū)段相結(jié)合的可能是MRFs(Myogenic Regulatory Factors)家族成員。
　　5.進(jìn)一步的蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在肺癌細(xì)胞系中僅有上述兩個(gè)家族中的C/EBPβ和MyoD、Myf5的表達(dá)。
　　6.凝膠滯留實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在肺癌細(xì)胞的核蛋白中確實(shí)存在著能夠與NGAL基因調(diào)控序列相結(jié)合的成分。進(jìn)一步的超滯留實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與NGAL基因調(diào)控序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子分別是C/EBPβ和MyoD。