AOPP對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用.pdf

1、目的：本研究將體外合成的晚期蛋白氧化產(chǎn)物(advanced oxidative product products，AOPP)與人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblast，HGF)共培養(yǎng)，觀察AOPP對(duì)HGF增殖、凋亡和合成基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix matelloproteinast-1，MMP-1)的影響。探討AOPP在糖尿病加重牙周病中的可能機(jī)制，并為其治療開辟新的途徑。 方法：①采用酶消化—

2、組織塊法進(jìn)行HGF原代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。取第3代HGF繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并用SABC法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白染色以鑒定細(xì)胞來源。體外合成晚期氧化修飾的人血清白蛋白(advanced oxidative protein product-human serum albumin，AOPP-HSA)。利用酸性條件下340nm處其吸光值測(cè)定AOPP濃度，并利用LPS試劑盒測(cè)定內(nèi)毒素含量。配制各種濃度的AOPP-HSA溶液。②取

3、第4代生長(zhǎng)良好的HGF，胰酶消化后以2.5×104個(gè)/ml等量接種于96孔板。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至相互融合時(shí)，分別與加入100、50、5 μg/ml AOPP-HSA含2％FBS的DMEM共培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、2、3 d，用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況并計(jì)算細(xì)胞抑制率。③取第4代生長(zhǎng)良好的HGF，胰酶消化后以3.5×105個(gè)/ml等量接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至相互融合時(shí)，分別加入含有或不含50μg/ml AOPP-HSA的DMEM無血

4、清培養(yǎng)基共培養(yǎng)72 h，收集各組細(xì)胞及其上清液，1200r/min，5min，加入0.3ml PBS制成細(xì)胞懸液，Annexin V-PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)AOPP-HSA對(duì)HGF凋亡的影響。④取第4代生長(zhǎng)良好的HGF，胰酶消化后以1.0×105個(gè)/ml等量接種于24孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至相互融合時(shí)，分別加入含有100、50、5、0.5μg/mlAOPP-HSA含2％FBS的DMEM共培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞上清液，6000r/m

5、in，30min以去除細(xì)胞殘?jiān)?，用ELISA測(cè)定上清液中MMP-1的水平。 結(jié)果：①HGF最早在第4 d從組織塊中爬出，大多呈梭形，胞漿豐滿，核仁清晰。一般10～15 d長(zhǎng)滿瓶底，可進(jìn)行傳代。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線符合HGF生長(zhǎng)特點(diǎn)，免疫組化結(jié)果顯示HGF波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，提示該細(xì)胞來源于中胚層，非上皮來源的細(xì)胞。AOPP-HSA樣本為棕黃色，經(jīng)測(cè)定內(nèi)毒索含量均<0.025EU/ml，利用酸性條件下340nm處其吸光度值

6、測(cè)得AOPP-HSA濃度為4.8mg/ml。②MTT結(jié)果顯示：分別在復(fù)合培養(yǎng)的第1、2、3 d，各濃度組AOPP-HSA抑制HGF增殖，抑制率隨著濃度增加而升高，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但50ug/ml和100ug/ml兩組抑制率在共培養(yǎng)第3d無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。50ug/ml和100ug/ml兩組抑制率存在時(shí)間差異性，在共培養(yǎng)的第2d達(dá)到最高(P<0.05)，而5ug/ml組抑制率隨時(shí)間變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。③加入AOPP

7、-HSA的無血清DMEM誘導(dǎo)72 h后，Annexin V-PI雙染，流式細(xì)胞儀所形成的散點(diǎn)圖上實(shí)驗(yàn)組比之對(duì)照組凋亡率有輕度增加，但兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。④EIJSA結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示AOPP-HSA各濃度組HGF中MMP-1的合成量都高于對(duì)照組(P<0.05)。另外，不同濃度組之間MMP-1的合成量亦存在差異(P<0.05)，其合成量隨著AOPP濃度升高而增加。 結(jié)論：①AOPP可能通過抑制HGF增殖，影響牙