成年哺乳動物視網膜神經細胞再生的相關研究.pdf

1、青光眼、視神經外傷、視網膜色素變性等疾病是眼科臨床中高發(fā)的不可逆致盲性眼病,極大地危害了患者的身心健康。由于在成年哺乳動物中,損傷的視網膜神經細胞無法再生,故治療效果差,治療手段有限,是臨床上的一大難題。本研究從兩方面著手:一是神經軸突受損而神經元胞體還存活的病理狀況,我們致力于通過研發(fā)組織工程神經導管促進成年哺乳動物體內的視神經軸突再生來修復:另一方面是神經細胞也損傷失活、殘存的神經細胞不足以維持正常神經功能的病理狀況,我們將成年哺乳

2、動物體內的內源性因子ephrinA3作為靶點,研究其對視網膜干細胞增殖和分化的調節(jié)作用,從而為治療各種累及視網膜神經細胞的疾病打下基礎。
　　第一部分:一種新的組織工程化導管移植促進成年大鼠視神經再生的實驗研究
　　目的:通過研發(fā)一種新的可降解的組織工程化導管,移植在損傷的視神經斷端促進成年大鼠的視神經軸突生長,從而探索外源性微環(huán)境改變對促進視神經再生的作用。
　　方法:
　　(1)制備轉基因雪旺細胞:構建GFP

3、-CNTF真核細胞表達質粒,用電穿孔法將其轉染培養(yǎng)的雪旺細胞,在轉染后3小時-7天在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達時間和轉染效率。在細胞轉染CNTF后24小時,用RT-PCR檢測CNTF的mRNA表達情況,并且用免疫組化檢測CNTF蛋白的表達情況,從而證實基因的轉染效果。
　　(2)制備組織工程化導管:用PGA細絲填充于中空的PLGA導管中,然后分別將轉染CNTF的雪旺細胞或單純雪旺細胞填充入導管,并過夜培養(yǎng),使細胞更好地貼附。<

4、br>　　(3)動物實驗:用成年SD大鼠,分成3組,每組6-8只,分別為:
　　①轉基因雪旺細胞導管組。
　　②雪旺細胞導管組。
　　③空導管組。
　　首先手術造成大鼠視神經橫斷傷,然后將各種導管縫合至大鼠視神經近側斷端。
　　(4)評價再生效果:導管移植4周后,用再生軸突標記物GAP-43抗體標染各組導管的冰凍切片,每張切片從視神經斷端開始,每625微米作為一個計數點,每只大鼠取5張切片進行計數并取得每個

5、距離計數點再生軸突的平均數,然后對每個距離計數點的再生軸突數量在三命實驗組之間用One Way Anova進行統(tǒng)計分析。同時,用透射電鏡觀察導管內部雪旺細胞的存活和再生軸突的微細結構。
　　(5)觀察導管炎癥及降解情況:用巨噬細胞和小膠質細胞標記物OX42抗體標染導管冰凍切片以觀察導管內炎癥反應的情況,并在移植后4周和2個月觀察導管材料的降解情況。
　　結果:
　　(1)成功制備轉基因雪旺細胞:測序證明GFP-CNTF

6、質粒構建成功,將質粒轉染雪旺細胞后3小時綠色熒光開始表達,24小時達到高峰,可持續(xù)一周。將質粒轉染雪旺細胞24小時后,RT-PCR結果可見轉染CNTF的雪旺細胞有較高的CNTF mRNA表達,免疫組化結果顯示轉染CNTF的雪旺細胞表達CNTF,從而證實了該基因轉染方式的有效性。
　　(2)GAP43免疫組化計數再生神經纖維:將三種導管移植在成年大鼠視神經橫斷傷末端4周后,用GAP43標染組織工程化導管內的再生神經纖維。在距離視乳頭

7、1875μm的導管內部,單純雪旺細胞導管組再生軸突的數量(14.3±2.94/mm/section)和轉染CNTF的雪旺細胞導管組再生軸突的數量(16.2±1.56/mm/section)明顯高于對照空導管組(5±2.06/mm/section,P＜0.05,one way anova,n=6或8).說明該組織工程化導管填充雪旺細胞后具有明顯的促進視神經再生的作用。在離視神經斷端約5000μm的導管內部,轉基因雪旺細胞導管組的再生軸突數

8、量為4.23±1.18/mm/section,而單純雪旺細胞導管組的再生軸突數量為1.33±0.58/mm/seetion,兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,t檢驗,n=6或8)。在離視神經約5625μm的導管內部,轉基因雪旺細胞導管組的再生軸突數量為2.86±1.08/mm/secfion,而單純雪旺細胞導管組的再生軸突數量為0.3±0.1/mm/section,兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,t檢驗,n=6或8)。說明

9、移植轉染CNTF的雪旺細胞填充的神經導管組的再生效果比移植單純雪旺細胞填充的神經導管組好。
　　(3)電鏡觀察再生軸突:導管移植4周后,電鏡觀察見導管內轉基因的雪旺細胞導管內仍可見存活的雪旺細胞,并且可見再生神經纖維,從而進一步證實了軸突的再生。
　　(4)導管內部炎癥情況和導管降解情況的觀察:巨噬細胞和小膠質細胞標記物OX42對導管冰凍切片的免疫組化染色顯示移植4周后,導管內沒有嚴重的炎癥反應。導管在體內移植后2個月后降解

10、。
　　結論:我們成功研制了一種新的可降解的組織工程化神經導管,可以有效地促進成年大鼠的視神經再生.該導管的研發(fā)為將來治療各種神經軸突損傷性疾病打下一定研究基礎。
　　第二部分:EphrihA3對成年小鼠視網膜干細胞增殖及分化作用的研究
　　目的:探索ephrinA3在成年小鼠視網膜干細胞龕內的作用,并探討其作用機制,為尋找新的調節(jié)視網膜干細胞增殖和分化的靶點,從而為調控視網膜干細胞增殖和分化,治療各種視網膜神經細胞變

11、性疾病打下基礎。
　　方法:
　　(1)檢測ephrinA3在小鼠視網膜上的表達情況:用Western blot檢測不同年齡的小鼠視網膜內ephrinA3的表達趨勢,并用免疫組化的方法觀察在成年小鼠的視網膜ephrinA3的表達部位。
　　(2)在體實驗觀察ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠視網膜干細胞的增殖情況:用Brdu活體標記,免疫組化染色,并在熒光顯微鏡下計數觀察成年ephrinA3基因敲除鼠和成年野生鼠體內的

12、視網膜干細胞增殖情況。
　　(3)體外實驗觀察ephrinA3對視網膜干細胞增殖的影響:離體培養(yǎng)ephrinA3基因敲除小鼠和野生鼠視網膜干細胞,比較其形成原代和第二代神經球的數量,另外用BrdU摻入實驗比較兩種視網膜干細胞的增殖能力。培養(yǎng)野生型視網膜干細胞,加入ephrinA3蛋白,比較加入ephrinA3蛋白組和對照組干細胞的增殖能力。
　　(4)比較兩種神經球干細胞標記物的表達情況:用Real-time PCR及RT-

13、PCR的方法比較兩種神經球的各種干細胞標記物的表達情況。
　　(5)比較兩種視網膜干細胞的分化情況:體外誘導分化視網膜干細胞,并用各種細胞標記物標染以觀察其分化情況。用Real-time PCR的方法比較干細胞分化前后干細胞標記物的表達情況,以及比較ephrinA3基因敲除干細胞和野生型干細胞分化后各種視網膜細胞標記物的表達情況。
　　(6)ephfinA3受體分子的研究:用。RT-PCR檢測在野生型神經球中EphA4和Ep

14、hA7的表達情況,并用免疫沉淀檢測野生鼠睫狀體上皮組織中ephrinA3的相應受體,用免疫組化檢測EphA4在成年小鼠視網膜中的表達部位,并用western blot檢測ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠睫狀體上皮組織中EphA4磷酸化程度的不同,從而推測EphA4和ephrinA3之間的關系。
　　(7)探索ephrinA3作用的下游分子通路:用Wnt3a加入培養(yǎng)的野生型視網膜干細胞中,通過檢測BrdU摻入實驗來觀察Wnt3a對

15、視網膜干細胞增殖能力的影響。用Western blot檢測ephrinA3基因敲除視網膜干細胞和野生型視網膜干細胞中Wnt3a的下游通路分子β-catenin的表達及該分子的磷酸化程度,從而推測ephrinA3的下游分子通路。
　　結果:
　　(1)ephrinA3在小鼠視網膜上的表達情況:Western blot結果顯示,ephrinA3從出生后10天開始可以在視網膜組織中檢測得到,在成年期表達有所增強。在成年小鼠的視網膜

16、,ephrinA3主要表達在視網膜的內叢狀層和外叢狀層,并較低地表達在睫狀體上皮組織。
　　(2)在體實驗觀察ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠視網膜干細胞的增殖情況:通過BrdU活體標記后染色計數可知,成年ephrihA3基因敲除鼠睫狀體邊緣部的增殖細胞數量為0.0835±0.0478個/切片,明顯多于成年野生型小鼠睫狀體邊緣部的增殖細胞數量0.00337±0.00337個/切片(P＜0.05,Mann-Whitney Rank

17、 Sum Test,n=9)。而且增殖細胞可同時標染干細胞標記物Chx10,說明這些增殖細胞為視網膜的干細胞。
　　(3)體外實驗觀察ephrinA3對視網膜干細胞增殖的影響:在離體培養(yǎng)中發(fā)現,ephrinA3基因敲除鼠組所生成的原代神經球的數量是野生型小鼠組的1.72±0.07倍(P＜0.01,t檢驗,n=3);ephrihA3基因敲除小鼠組生成第二代神經球的數量是野生型小鼠組的2.13±0.235倍(P＜0.01,t檢驗,n=

18、3);ephrihA3基因敲除小鼠組的視網膜干細胞BrdU摻入百分比(57.5％±2.4％)高于野生小鼠組(34％±5.2％)(P＜0.05,t檢驗,n=3),說明ephrinA3基因敲除組視網膜干細胞的增殖能力高于野生小鼠的視網膜干細胞。如果在培養(yǎng)皿中加入ephrinA3蛋白,野生型的視網膜干細胞BrdU摻入百分比會從原來的33.8％±0.8％下降至25.6％±0.8％(P＜0.05,t檢驗,n=3),進一步說明了ephrihA3蛋白

19、對視網膜干細胞增殖的抑制性作用。
　　(4)比較兩種神經球干細胞標記物的表達情況:Rod-time PCR結果證實,ephrinA3基因敲除的視網膜干細胞的各種干細胞標記物的表達量高于野生型視網膜干細胞,尤其是Writ家族表達上調最為明顯。
　　(5)比較兩種視網膜干細胞的分化情況:分化實驗中證實,視網膜干細胞可以分化為多種不同種類的視網膜細胞。Realtime PCR結果顯示ephrinA3基因敲除的視網膜干細胞分化后比野

20、生型視網膜干細胞分化后表達更高的感光細胞標記物rhodopsir/和rocovorin,說明ephrinA3基因敲除鼠視網膜干細胞具有更強的分化潛能。
　　(6)ephrinA3受體分子的研究:RT-PCR證實在視網膜干細胞內EphA4的表達遠高于EphA7,免疫沉淀實驗證實在睫狀體上皮細胞內EphA4是ephrinA3的受體分子。免疫組化顯示EphA4表達在睫狀體上皮上。Western blot結果證實野生型小鼠的睫狀體上皮組織

21、的EphA4磷酸化程度高于ephrinA3基因敲除鼠的睫狀體上皮組織。證實EphA4是ephrinA3在睫狀體上皮細胞上的受體。
　　(7)ephrinA3調節(jié)視網膜干細胞增殖的下游分子通路:加入Wnt3a后,視網膜干細胞的BrdU摻入百分比明顯升高,Western blot結果顯示在ephrinA基因敲除鼠視網膜干細胞原代神經球里β-catenin(Wnt3a的下游通道分子)和磷酸化的β-catenin的表達比野生鼠均有提高,故

22、認為而Wng/β-catonin分子通路可能是ephrinA3參與調節(jié)視網膜干細胞增殖的的下游通路。
　　結論:ephrinA3是小鼠成年視網膜干細胞龕中的一種內源性抑制性分子,它可能通過視網膜干細胞上的EphA4受體,調控下游Wng/β-catenin分子通路來抑制視網膜干細胞的增殖和分化。對ephrinA3的作用及其機制的了解,為將來調控體內視網膜干細胞增殖和分化,治療臨床疾病方面打下了一定的基礎。下一步將研究敲除遺傳性視網膜