表達(dá)犬瘟熱病毒H基因重組狂犬病病毒生物學(xué)特性的研究.pdf

1、學(xué)校代碼：10564學(xué)號：2013202843分類號：S852.65密級：碩士學(xué)位論文表達(dá)犬瘟熱病毒H基因重組狂犬病病毒生物學(xué)特性的研究趙靜指導(dǎo)教指導(dǎo)教師：郭霄峰教授學(xué)院名學(xué)院名稱：獸醫(yī)學(xué)院專業(yè)名專業(yè)名稱：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)答辯委員會主席：答辯委員會主席：陳金頂教授中國廣州2016年6月摘要狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（RabiesvirusRABV)引起的一種人獸共患傳染病，在全球范圍內(nèi)流行，是目前病死率最高的傳染病之一，一旦感染出現(xiàn)

2、臨床癥狀，幾乎100%的死亡。犬瘟熱（CanineDistemper，CD）是由犬瘟熱病毒（CanineDistempervrus，CDV）引起的高度接觸性傳染病，它在全球范圍內(nèi)流行，死亡率高達(dá)80％，給養(yǎng)犬業(yè)和毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的危害。預(yù)防接種是控制狂犬病和犬瘟熱的主要途徑。目前，傳統(tǒng)的狂犬病弱毒疫苗成本低廉，但存在毒力殘留或致病性回復(fù)突變的安全隱患；進(jìn)口疫苗安全性高，免疫效果好，但價格昂貴，難以廣泛推廣使用。研制安全、高效、成本

3、低廉的動物狂犬病疫苗，仍具現(xiàn)實(shí)意義。市場上應(yīng)用廣泛的犬瘟熱疫苗存在熱穩(wěn)定性差、免疫效果易受母源抗體干擾等多重問題。因此，研制安全、高效的新型CD疫苗具有重要意義。本研究利用已建立的狂犬病病毒（RabiesvirusRABV)反向遺傳操作技術(shù)平臺，在通過反向遺傳拯救的狂犬病病毒弱毒株HEPdG的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)在狂犬病病毒（HEPdG株）基因組G與L之間再插入犬瘟熱病毒H基因，構(gòu)建了重組全長cDNA質(zhì)粒pHEPdG（H），成功拯

4、救出同時表達(dá)狂犬病病毒雙G蛋白和犬瘟熱病毒H蛋白的重組狂犬病病毒HEPdG（H）。通過對重組病毒的生物學(xué)特性研究，該重組狂犬病毒HEPdG（H）可以在BHK細(xì)胞上穩(wěn)定的增殖，達(dá)到較高的病毒滴度。抽取該重組病毒第2、5、10代的RNA，進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增H、dG基因并測序，基因未發(fā)生突變。熒光定量PCR和Westernblot驗(yàn)證表明外源基因H和dG能夠表達(dá)。病毒的生長曲線表明HEPdG（H）保持著與HEPdG毒株相似的生長特性，在96h

5、達(dá)到高峰，但重組病毒HEPdG（H）的滴度在每個時間點(diǎn)略低于HEPdG毒株。病毒的擴(kuò)散感染實(shí)驗(yàn)顯示在低MOI的情況下，重組病毒HEPdG（H）的擴(kuò)散能力不及HEPdG毒株，這與生長曲線相吻合。致病性實(shí)驗(yàn)顯示，重組病毒HEPdG（H）與HEPdG對67周齡成鼠沒有致死性，且重組病毒HEPdG（H）對成鼠體重的影響弱于HEPdG；而對3日齡內(nèi)的乳鼠，結(jié)果顯示HEPdG（H）的致命性高于HEPdG。免疫原性實(shí)驗(yàn)顯示，重組病毒HEPdG（H）與