新疾病外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫痤瘡丙酸桿菌腦感染的分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)證據(jù).pdf

1、引言：
　　1996年，本課題組發(fā)現(xiàn)了一種發(fā)生于面部皮膚外傷愈合后的肉芽腫性疾病，患者晚期均累及腦組織。該病患者主要表現(xiàn)為面部輕重不一的外傷，愈合后出現(xiàn)進(jìn)行性增大的暗紅色斑塊，后期腦組織受累，主要表現(xiàn)為腦炎，患者全部在1-4年死亡。根據(jù)患者均有外傷史、病理示肉芽腫性炎癥、電鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，患者全部死亡等特點(diǎn)，將此疾病命名為：外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫(fatal bacterial granuloma after trauma,FBG

2、T)。經(jīng)過(guò)十余年對(duì)該疾病發(fā)病機(jī)制的探索，初步取得了以下進(jìn)展：1，使用改良培養(yǎng)基在患者皮損組織中成功分離培養(yǎng)出痤瘡丙酸桿菌(propionibacterium acnes,P.acnes)，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，在皮損及病變腦組織中成功擴(kuò)增出P.acnes的16SrRNA全序列，由此明確P.acnes為新疾病FBGT的病原菌，明確了患者的死亡原因?yàn)镻.acnes所致的腦感染。2，依據(jù)FBGT的臨床特點(diǎn)，在大量閱讀文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，提出

3、IAM基因多態(tài)性引起相應(yīng)分子功能的缺陷是FBGT發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)，并在一例患者中證實(shí)了該假說(shuō)。3，通過(guò)分型鑒定，明確FBGT和尋常痤瘡的病原菌P.acnes絕大部分屬于致病力相對(duì)較低的IA亞型。4，在研究P.acnes生物膜(biofilm,BF)形成的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)P.acnes形成BF后耐藥性顯著升高，解釋了FBGT治療過(guò)程中藥敏試驗(yàn)結(jié)果和臨床療效不符合的現(xiàn)象，并進(jìn)一步研究了P.acnes在體內(nèi)形成BF的機(jī)制。然而，患者腦脊液及病變處腦組

4、織的細(xì)菌分離培養(yǎng)一直未能成功，而免疫組化方法未能明確腦內(nèi)是否確實(shí)存在細(xì)菌，PCR方法成功擴(kuò)增P.acnes 16S rRNA的研究結(jié)果雖具有一定說(shuō)服力，但仍難以給出令人信服的腦感染依據(jù)，腦內(nèi)細(xì)菌感染的直接證據(jù)成了對(duì)該課題進(jìn)行深入研究的瓶頸。
　　目的：
　　通過(guò)分子生物學(xué)方法，證明FBGT的腦感染病原體與皮損相同；通過(guò)分子生物學(xué)結(jié)合形態(tài)學(xué)的方法，對(duì)FBGT患者的腦損害組織進(jìn)行病原菌細(xì)胞定位，確認(rèn)FBGT患者的腦感染系繼發(fā)于面

5、部皮損的痤瘡丙酸桿菌感染。
　　方法：
　　1.運(yùn)用Oligo6.0軟件和在線工具Primer-BLAST針對(duì)P.acnes的16S rRNA和脂肪酶(Lipase)編碼序列設(shè)計(jì)合成兩套用于巢氏聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nested polymerase chain reaction,nPCR)的特異性引物，優(yōu)化nPCR反應(yīng)體系及條件，以FBGT患者皮損處DNA和病變腦組織處DNA為模板，擴(kuò)增P.acnes的16SrRNA及Lipas

6、e編碼序列。
　　2.使用nPCR實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增P.acnes16SrRNA的第二對(duì)引物擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)菌株，以該目的片段為模板，制備地高辛標(biāo)記的cRNA探針，通過(guò)原位雜交(in situ hybridization,ISH)和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)的方法將病原菌mRNA定位于患者的病變腦組織內(nèi)。
　　結(jié)果：
　　1.擴(kuò)增9份FBGT患者的皮損及病變腦組織中的

7、病原菌序列后發(fā)現(xiàn)：在16SrRNA(PAS)引物組中，使用第一對(duì)引物擴(kuò)增后，除陽(yáng)性對(duì)照外，患者樣本中無(wú)明確條帶出現(xiàn)；將產(chǎn)物1：1000稀釋后使用第二對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，其中7份樣本中出現(xiàn)條帶，但清晰度欠佳。將相同DNA模板使用Lipase(LIP)引物進(jìn)行擴(kuò)增，第一對(duì)引物擴(kuò)增后，除陽(yáng)性對(duì)照外，9份模版中的8份在目的片段大小處出現(xiàn)了淺條帶，此后稀釋產(chǎn)物，使用第二對(duì)引物繼續(xù)擴(kuò)增，9份從患者中提取的組織DNA樣本均出現(xiàn)了明確均一的目的條帶。同批設(shè)

8、置空白對(duì)照，結(jié)果無(wú)條帶出現(xiàn)。測(cè)序后經(jīng)BLAST比對(duì)，明確為P.acnes。
　　2.使用ISH和FISH的方法對(duì)FBGT患者腦部液化壞死區(qū)域中P.acnesmRNA進(jìn)行原位雜交后，可觀察到陽(yáng)性信號(hào)在組織內(nèi)分布廣泛，多位于細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)核染料DAPI復(fù)染后，進(jìn)一步確認(rèn)P.acnes的mRNA雜交信號(hào)分布于胞內(nèi)，且在部分視野中可見(jiàn)信號(hào)存在于多個(gè)核細(xì)胞中。同批實(shí)驗(yàn)使用正義探針進(jìn)行原位雜交的患者腦組織中，和反義探針進(jìn)行原位雜交的正常腦組織內(nèi)均