新疾病外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫病原菌——痤瘡丙酸桿菌生物膜三維模型重建及生物膜與微環(huán)境pH的相互作用.pdf

1、外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫(Fatal bacterial granuloma after trauma,FBGT)是一種慢性致死性感染性疾病,絕大多數(shù)繼發(fā)于輕微的面部皮膚外傷,1996年由我科高天文教授發(fā)現(xiàn)并命名。在國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30271196)支持下,已明確FBGT的病原菌為痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes, P. acnes),患者的死亡原因系P. acnes引起的腦感染。課題組在病原體培養(yǎng)及藥

2、物敏感試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)收治的FBGT患者進(jìn)行大量、聯(lián)合、交替的抗感染治療,但仍有多位患者死亡。闡明體外藥敏試驗(yàn)敏感的抗生素在臨床體內(nèi)治療中效果不佳,成為揭示FBGT發(fā)病機(jī)理和有效挽救患者生命的關(guān)鍵問題。生物膜(biofilm,BF)是細(xì)菌的一種生存模式,其中的細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性顯著升高。BF耐藥理論能合理解釋FBGT患者P. acnes體外培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和臨床治療效果的不一致性。
　　本課題組齊顯龍博士在國家自然科學(xué)基金(306

3、70117)資助下成功在體外構(gòu)建了P. acnes BF模型,通過掃描電鏡觀察初步確定其結(jié)構(gòu)特點(diǎn),并證實(shí)BF能夠大大增加P. acnes對(duì)林可霉素等抗生素的耐藥性,初步解釋了FBGT患者病程中P. acnes體外培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和臨床治療效果的不一致性。但是迄今為止,國內(nèi)外仍缺乏對(duì)P. acnes BF三維(three dimensional,3D)立體結(jié)構(gòu)的詳細(xì)觀察和了解。宿主對(duì)P. acnes的免疫反應(yīng)早期是單核巨噬細(xì)胞的固有免疫反

4、應(yīng),后期主要是以Th1為主的獲得性免疫。通常P. acnes會(huì)被單核巨噬細(xì)胞吞噬并殺傷,不能導(dǎo)致慢性肉芽腫性感染,而FBGT中P. acnes能夠在組織中長期存活,并不能被呈現(xiàn)酸性pH的溶酶體殺傷。
　　結(jié)合本課題組既往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和課題思路,在宿主單核巨噬細(xì)胞和Th1型細(xì)胞免疫功能缺陷的條件下,P. acnes在溶酶體中的酸性環(huán)境中生存,可能會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生BF,可以在一定程度上解釋FBGT發(fā)病機(jī)理。為此,我們從P. acnes BF

5、3D模型重建及BF與微環(huán)境pH相互作用兩方面進(jìn)行研究,期望能為FBGT發(fā)病及耐藥機(jī)制的明確及有效治療打下一定基礎(chǔ),并推動(dòng)P. acnes相關(guān)疾病的研究。目的1、通過多重?zé)晒馊旧⒓す夤簿劢癸@微鏡(confocal scanning laser microscopy,CSLM)和圖像3D模型重建技術(shù),對(duì)P. acnes BF中活菌、死菌及細(xì)胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS)分別進(jìn)行標(biāo)

6、記,觀察不同孵育時(shí)段BF的變化規(guī)律,進(jìn)一步明確P. acnes BF內(nèi)部的詳細(xì)結(jié)構(gòu)及特征。2、在不同pH值微環(huán)境中構(gòu)建P. acnes BF的體外模型,分析微環(huán)境pH在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)P. acnes形成BF的影響和對(duì)BF中P. acnes增殖的作用,并反向觀察P. acnes BF對(duì)微環(huán)境pH的影響。進(jìn)一步探討P. acnes對(duì)不同pH值微環(huán)境的耐受及形成BF的能力,為闡明P. acnes的致病力提供新的證據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：1、P

7、. acnes BF三維模型重建。1.1在玻璃蓋玻片表面構(gòu)建體外P. acnes BF模型,所選的觀察時(shí)間點(diǎn)分別為5d、10d、15d和20d。1.2用針對(duì)活菌的熒光染料二乙酸熒光素(fluorescein diacetate,FDA)和熒光標(biāo)記的細(xì)菌多糖特異性植物凝集素羅丹明標(biāo)記的伴刀豆素A(rhodamine-ConA),對(duì)P. acnes活菌、死菌及大分子EPS中的多糖分別進(jìn)行標(biāo)記。1.3 CLSM觀察不同時(shí)間段BF內(nèi)部P. ac

8、nes活菌、EPS及死菌的變化規(guī)律;采用軟件進(jìn)行3D重建,明確P. acnes BF表面及內(nèi)部詳細(xì)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。2、P. acnes BF和微環(huán)境pH相互作用。2.1在96孔板中構(gòu)建不同pH值微環(huán)境中體外P. acnes BF模型。pH分3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0共15組,BF形成時(shí)間分為24h、48h、72h和96h,無菌pH7.0培養(yǎng)液作為陰

9、性對(duì)照,空白孔作為空白對(duì)照。2.2不同pH值及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)P. acnes形成BF的作用。使用結(jié)晶紫(crystal violet,CV)比色法,結(jié)合于黏附的細(xì)菌及其BF中,用33％乙酸水溶液將結(jié)合的CV溶解后,觀察590nm波長OD值,分析不同pH微環(huán)境和不同孵育時(shí)間對(duì)P. acnes形成BF的作用。2.3不同pH值及孵育時(shí)間對(duì)BF中P. acnes增殖的作用通過2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺

10、酸苯)-2H-四唑單鈉鹽-吩嗪硫酸甲酯(XTT-PMS)比色法,比較pH和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BF中P. acnes增殖的作用,探討P. acnes在體外不同pH微環(huán)境中的生存能力及形成BF的規(guī)律,為研究P. acnes抵御宿主體內(nèi)不同器官、組織、細(xì)胞如皮脂、胃液、膽汁及吞噬細(xì)胞內(nèi)的殺傷作用提供理論依據(jù)。2.4 P. acnes BF對(duì)培養(yǎng)基pH值的影響通過檢測不同培養(yǎng)時(shí)間之后,液體培養(yǎng)基pH值的改變,探討P. acnes在形成BF過程中對(duì)局部微

11、環(huán)境的主動(dòng)調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果與討論：本研究在體外構(gòu)建P. acnes BF模型,除不同pH值之外未增加其他微環(huán)境的干預(yù)因素,在實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)條件下觀察P. acnes及其BF自然發(fā)展過程的特點(diǎn)和規(guī)律。
　　1、P. acnes BF3D模型重建
　　1.1長時(shí)間培養(yǎng)P. acnes BF內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察。5d至20d的培養(yǎng)過程中,在P. acnes BF內(nèi)部單一層面掃描發(fā)現(xiàn)以下特點(diǎn):(1)BF中的活細(xì)菌隨著BF的發(fā)展而逐

12、漸減少,并逐漸向集落狀聚集。P. acnes BF在達(dá)到成熟期后,其內(nèi)部一直有較多活細(xì)菌存在,但當(dāng)BF發(fā)展到20d時(shí),活菌數(shù)目會(huì)明顯減少,主要分布特征為呈菌落狀聚集。(2)EPS的聚集趨勢先于活細(xì)菌發(fā)生,后期形成高密度山脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)。P. acnes BF的EPS隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,從散在顆粒狀逐漸融合聚集,最后形成高密度山脊?fàn)睢?3)成熟期P. acnes BF的發(fā)展過程中,活細(xì)菌逐漸在厚密的EPS部位內(nèi)部聚集成菌落。P. acnes B

13、F發(fā)展到晚期,其內(nèi)部活菌逐漸減少,活細(xì)菌的分布逐漸和EPS的聚集趨勢一致,到培養(yǎng)20d時(shí)絕大多數(shù)活細(xì)菌都被厚密EPS包裹。還可見未被EPS包裹的活細(xì)菌,這些游離的細(xì)菌很可能就是BF發(fā)展到后期釋放出的浮游狀態(tài)細(xì)菌。
　　1.2 P. acnes BF3D模型重建。培養(yǎng)20d后,P. acnes BF表面幾乎全部被不同厚度的EPS所包裹。典型蘑菇狀突起部分EPS尤為明顯,在蘑菇樣結(jié)構(gòu)下方可以觀察到寬大的通道結(jié)構(gòu)和突起部向基底部平緩延伸

14、的部分。在P. acnes BF的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中,活細(xì)菌大部分呈小菌落狀聚集在蘑菇樣結(jié)構(gòu)內(nèi),表面覆蓋著厚密的EPS,在BF較薄的部分發(fā)現(xiàn)了活細(xì)菌和EPS相互交織融合的結(jié)構(gòu),活細(xì)菌菌體較小。在BF培養(yǎng)的過程中,隨著時(shí)間的延長,BF中活P. acnes明顯減少而EPS逐漸增加,可能由于增多的EPS在保護(hù)P. acnes的同時(shí)也減少了外環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸,使部分P. acnes由于營養(yǎng)缺乏而死亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的活菌減少而BF增大,活菌在EPS厚密

15、部分內(nèi)部聚集的現(xiàn)象可能和細(xì)菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system, QSS)的作用相關(guān)。在實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)條件下,孵育20d后P. acnes在光面玻璃表面形成了BF,而且在蘑菇樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部厚密的EPS保護(hù)下仍有活細(xì)菌菌落生存,充分證明P. acnes的生存能力很強(qiáng),有引起慢性遷延感染的能力,并產(chǎn)生BF抵御抗生素的殺傷作用。提示臨床工作中,一旦出現(xiàn)P. acnes感染,應(yīng)早期足量使用敏感抗生素,防止BF形成,導(dǎo)致難治性

16、感染的出現(xiàn)。
　　2 、P. acnes BF和微環(huán)境相互作用研究。
　　2.1不同pH值及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)P. acnes形成BF的作用。各培養(yǎng)時(shí)段內(nèi)不同pH組形成BF的量有明顯差異。從培養(yǎng)24h時(shí)開始,pH3.5-9.0組在590nm OD值均隨時(shí)間有不同程度的升高,在96h BF的形成到達(dá)前期研究確定的平臺(tái)期時(shí),只有pH4.0-8.5明顯高于陰性對(duì)照組和pH3.0-3.5、pH9.0-10.0組(P＜0.05)。各時(shí)段內(nèi)pH

17、5.5-7.0形成BF量始終明顯高于其他組(P＜0.05),峰值均在pH6.5。各pH組形成BF的速度也有明顯差異。pH4.5-7.0從24h到96h形成BF的速度明顯高于其他pH組(P＜0.05)。
　　2.2不同pH值微環(huán)境和孵育時(shí)間對(duì)BF形成過程中P. acnes增殖的作用。不同pH和孵育時(shí)間對(duì)BF形成過程中P. acnes增殖的作用與對(duì)形成BF作用規(guī)律相似。96h時(shí)pH4.0-8.5 P. acnes的增殖明顯高于陰性對(duì)照

18、組和pH3.0-3.5、pH9.0-10.0組(P＜0.05),各時(shí)段內(nèi)pH5.5-7.0組P. acnes的增殖明顯高于其他組(P＜0.05),峰值在pH6.0和pH6.5,兩組之間沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。pH4.5-7.5組P. acnes隨時(shí)間增殖的速度明顯高于其他組(P＜0.05)。
　　2.3不同孵育時(shí)間之后,培養(yǎng)液pH值的變化。培養(yǎng)96h后檢測各組培養(yǎng)液pH的改變,發(fā)現(xiàn)pH3.0-5.5組pH值均有不同程度

19、的增加,而pH7.5-8.5組則有所減小,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無明顯差異(P＞0.05)。P. acnes能在pH4.0-8.5形成BF,最適宜范圍在pH4.5-7.0,其中在pH5.5-7.0 P. acnes能較快的形成BF,證明中性偏酸環(huán)境適合P. acnes的擴(kuò)增并形成BF。目前文獻(xiàn)報(bào)道和P. acnes有關(guān)的疾病主要有FBGT、痤瘡、結(jié)節(jié)病、感染性心內(nèi)膜炎、顱內(nèi)感染、骨關(guān)節(jié)術(shù)后感染、原發(fā)性膽汁性肝硬化、前列腺增生、眼內(nèi)炎等,累及皮膚

20、、血液、腦、骨、肝臟、眼等多種器官組織。人體大部分組織和體液均在pH7.0左右,上述人體組織其局部微環(huán)境pH均在4.0-8.5之內(nèi),適合P. acnes生存和擴(kuò)增。BF的形成,一方面使P. acnes牢固黏附在組織中,另一方面使P. acnes能夠有效提高對(duì)抗生素等抗菌藥物的耐藥性,從而在組織中形成慢性遷延的感染。細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng),包括一些強(qiáng)酸強(qiáng)堿的極端惡劣環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)96h后培養(yǎng)液pH值均向中性的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但

21、是這提示P.acnes可能具有主動(dòng)調(diào)節(jié)微環(huán)境的功能。P.acnes等細(xì)菌對(duì)微環(huán)境特別是pH的適應(yīng)與調(diào)節(jié)的機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入探索。溶酶體內(nèi)各種酶類均屬于酸性水解酶,反應(yīng)的最適pH值為5.0左右,如果溶酶體功能障礙,則不能保持內(nèi)部酸性環(huán)境。本研究證實(shí)P. acnes能夠在pH4.0生存并形成BF,即P.acnes可以在和正常溶酶體pH相同的微環(huán)境中存活。本研究結(jié)果填補(bǔ)了P.acnes及其BF和微環(huán)境pH相互關(guān)系研究的部分空白,為P.acn

22、es感染性疾病發(fā)病機(jī)理和抗感染治療提供了一定的理論依據(jù)。
　　結(jié)論：1、本研究通過對(duì)新疾病FBGT病原體P.acnes BF體外模型的3D重建和分析,進(jìn)一步深入闡明了P.acnes BF內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其發(fā)展過程和形態(tài)特點(diǎn)。
　　2、證實(shí)了P.acnes具有在pH4.0-8.5微環(huán)境中生存、增殖并形成BF的能力,可以部分解釋P.acnes在人體多種器官和組織中引起感染并產(chǎn)生抗生素耐藥的原因;支持了FBGT臨床治療抗生素耐藥系BF所