電荷對(duì)抗菌肽與生物膜相互作用的影響.pdf

1、抗菌肽（AMPs）廣泛存在于動(dòng)物、植物以及各種微生物中，他們?cè)谒拗鞯南忍烀庖叻烙到y(tǒng)中起重要作用。大多數(shù)抗菌肽整體上帶有正電荷（通常為2至9個(gè)），由10-50個(gè)氨基酸殘基組成，并且其序列中含有一定比例的疏水性氨基酸殘基（通?！?0％）?？咕脑谝患?jí)結(jié)構(gòu)上各不相同，但二級(jí)結(jié)構(gòu)上大多數(shù)抗菌肽屬于α-螺旋肽或β-折疊肽。抗菌肽與細(xì)胞膜接觸時(shí)可折疊成兩親性構(gòu)象，其帶正電荷的親水面與細(xì)菌細(xì)胞膜中帶負(fù)電荷的磷脂頭部基團(tuán)通過靜電相互作用結(jié)合，然后，其

2、疏水面通過疏水作用插入脂質(zhì)雙分子層中，破壞細(xì)胞膜的屏障功能，最終裂解細(xì)胞膜?？咕牟粌H能夠作用于微生物細(xì)胞膜，還能夠裂解真核細(xì)胞的細(xì)胞膜，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，這阻礙了其臨床應(yīng)用。通過不同方法來降低抗菌肽對(duì)真核細(xì)胞的毒性、提高抗菌肽對(duì)細(xì)菌的選擇性毒性是目前研究的熱點(diǎn)之一。此外，抗菌肽還被用于陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染應(yīng)用中，它能裂解酸性條件下的溶酶體膜從而增加轉(zhuǎn)染復(fù)合物從溶酶體的釋放，進(jìn)而增強(qiáng)陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率，增加多肽在酸性條件下的膜裂解

3、活性是其作為轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑的必要條件。因此我們的研究目的有兩個(gè)，一方面是通過對(duì)天然抗菌肽進(jìn)行氨基酸殘基替換，獲得對(duì)真核細(xì)胞毒性低而對(duì)細(xì)菌選擇性毒性高的多肽，以便于其臨床抗細(xì)菌感染的應(yīng)用；另一方面，通過對(duì)天然抗菌肽進(jìn)行氨基酸殘基替換來設(shè)計(jì)在酸性條件下膜裂解活性較強(qiáng)而在中性條件下細(xì)胞毒性較低的多肽，用于增強(qiáng)陽離子聚合物的轉(zhuǎn)染效率。
　　一、正電荷氨基酸殘基對(duì)抗菌肽選擇性毒性的影響。
　　我們首先通過對(duì)含有不同正電荷氨基酸殘基數(shù)的RV

4、-23、AR-23和melittin三個(gè)天然抗菌肽進(jìn)行對(duì)比研究，探索正電荷氨基酸殘基對(duì)抗菌肽物理特征及其對(duì)細(xì)菌和真核細(xì)胞膜的結(jié)合和裂解能力的影響。我們對(duì)比了三個(gè)抗菌肽的物理參數(shù)，例如螺旋性、疏水性和兩親性，同時(shí)檢測(cè)了三個(gè)抗菌肽的抑菌活性和真核細(xì)胞毒性?？紤]到抗菌肽可能應(yīng)用于人體，我們還評(píng)價(jià)了抗菌肽的血液相容性，我們研究了三個(gè)抗菌肽對(duì)血液關(guān)鍵成分如紅細(xì)胞和血小板的影響，還通過血栓彈力圖評(píng)價(jià)了抗菌肽對(duì)凝血纖溶系統(tǒng)的整體影響。其次，我們以AR

5、-23為模板，用帶正電荷的氨基酸殘基（Arg或Lys）取代其第1、8、或/和17位上不帶電荷的氨基酸殘基，設(shè)計(jì)了一系列AR-23改構(gòu)肽，用來研究正電荷氨基酸殘基的數(shù)目和分布對(duì)抗菌肽選擇性毒性的影響。我們測(cè)定了改構(gòu)肽在水溶液和不同膜模擬環(huán)境中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)了改構(gòu)肽的抑菌活性和抗生物膜活性以及改構(gòu)肽的溶血活性和對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并初步探索了改構(gòu)肽破壞細(xì)胞膜的機(jī)制。
　　結(jié)果顯示，三個(gè)天然抗菌肽均具有良好的抑菌活性，同時(shí)，具有

6、較多正電荷氨基酸殘基的RV-23對(duì)細(xì)菌的選擇性毒性較高，具有最高的治療指數(shù)，三個(gè)抗菌肽均具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中RV-23的α-螺旋含量最低，這可能與其真核細(xì)胞毒性低有關(guān)，同時(shí)RV-23的疏水性也較低，因?yàn)楦呤杷院透擀?螺旋含量可能與抗菌肽的高溶血活性相關(guān)，因此，RV-23對(duì)細(xì)菌的選擇性毒性高可能是由于其疏水性和α-螺旋性均較低。RV-23不僅對(duì)細(xì)菌的選擇性毒性較高，其對(duì)血液成分如紅細(xì)胞、血小板的影響也較小，對(duì)凝血纖溶系統(tǒng)的功能基

7、本沒有影響。正電荷氨基酸殘基的位置對(duì)抗菌肽的選擇性毒性影響較大，用帶正電荷的賴氨酸殘基取代AR-23疏水面上第17位異亮氨酸殘基能明顯改變多肽的疏水性、兩親性、螺旋性以及其溶血活性，然而，在親水面上用帶正電荷的氨基酸殘基進(jìn)行取代，對(duì)AR-23的物理性質(zhì)和生物活性影響較小。在AR-23疏水面上進(jìn)行取代能夠在保持其裂解細(xì)菌細(xì)胞膜活性的同時(shí)減少其對(duì)真核細(xì)胞膜的粘附和破壞。改構(gòu)肽A8（第1、8和17位殘基均被帶正電荷的氨基酸殘基取代）對(duì)細(xì)菌的選

8、擇性毒性最高，真核細(xì)胞毒性最低，同時(shí)A8還具有一定的抗生物膜能力。
　　二、電荷對(duì)抗菌肽在酸性條件下膜裂解活性的影響及其增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染效率的作用研究。
　　在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們通過將melittin和RV-23序列中帶正電荷的氨基酸殘基全部替換成帶負(fù)電荷的谷氨酸殘基來設(shè)計(jì)pH敏感肽，用于增強(qiáng)陽離子聚合物基因遞送載體的遞送效率，通過溶血實(shí)驗(yàn)和鈣黃綠素釋放實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)比了谷氨酸殘基替換后的改構(gòu)肽在中性和酸性pH條件下的膜裂解活性，

9、檢測(cè)了帶負(fù)電荷的改構(gòu)肽對(duì)陽離子遞送載體聚乙烯亞胺（PEI）/質(zhì)粒DNA復(fù)合物物理特征的影響，同時(shí)檢測(cè)了改構(gòu)肽對(duì)PEI/寡核苷酸（ODN）在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊?，最后我們?cè)u(píng)價(jià)了改構(gòu)肽增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率的能力及其細(xì)胞毒性。此外，我們還對(duì)AR-23帶正電荷的氨基酸殘基用谷氨酸殘基進(jìn)行系統(tǒng)地替換，研究抗菌肽谷氨酸殘基數(shù)對(duì)其pH敏感性的影響，同樣的我們通過溶血實(shí)驗(yàn)和鈣黃綠素釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了多肽凈電荷數(shù)對(duì)其在酸性pH條件下膜裂解活性的影響，還評(píng)

10、價(jià)了不同谷氨酸殘基數(shù)的多肽對(duì)聚賴氨酸（PLL）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率和對(duì)PLL/寡核苷酸（ODN）在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊憽?br>　　結(jié)果顯示，谷氨酸殘基替換后的抗菌肽在酸性pH條件下具有較高的α-螺旋率及較高的膜裂解活性，而在中性環(huán)境中的膜裂解能力顯著降低。谷氨酸殘基替換后的改構(gòu)肽不影響PEI縮合質(zhì)粒DNA的能力，而對(duì)PEI/DNA復(fù)合物的粒徑和zeta-電位有明顯的影響，透視電鏡顯示摻入改構(gòu)肽的PEI/DNA復(fù)合物聚團(tuán)、呈不規(guī)則的大顆粒。將

11、改構(gòu)肽摻入PEI/ODN復(fù)合物能明顯增強(qiáng)FITC-ODN釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)能夠增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率，而且僅少量增加PEI的細(xì)胞毒性?？咕墓劝彼釟埢鶖?shù)對(duì)其pH敏感性的影響較大。對(duì)AR-23而言，只有當(dāng)谷氨酸殘基數(shù)多于兩個(gè)時(shí)，其在酸性pH條件下的膜裂解活性才較高，只有含3個(gè)谷氨酸殘基的改構(gòu)肽增強(qiáng)PLL的轉(zhuǎn)染效率才較明顯，其增強(qiáng)PLL轉(zhuǎn)染效率的潛能高于常用的氯喹，并且產(chǎn)生的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于氯喹。
　　綜上所述，一方面通過對(duì)天然抗菌