頂體酶抑制劑對精子形態(tài)及功能的影響.pdf

1、[目的]目前絕大部分避孕方法均應(yīng)用于女性,且存在一定的不良反應(yīng)及副作用,因此,研究和發(fā)展男性避孕方法具有重要意義。精子頭部發(fā)生頂體反應(yīng)釋放的頂體酶協(xié)助精子穿越透明帶是人類受精過程中必不可少的步驟之一,故抑制精子頂體酶可阻斷受精過程。以頂體酶為靶點(diǎn),第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室呂加國教授等采用同源模建方法構(gòu)建人精子頂體酶的三維結(jié)構(gòu)模型,利用InsightII/Binding site方法準(zhǔn)確定位人精子頂體酶的活性位點(diǎn),通過柔性分子對接

2、技術(shù)建立并合成了一系列頂體酶抑制劑。本課題意在建立頂體酶抑酶活性篩選模型,通過殘余精子頂體酶活性檢測、體外試驗(yàn)及動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),研究精子頂體酶抑制劑抑制頂體酶的能力及對精子形態(tài)及功能的影響,為開發(fā)男性避孕藥、研究受精機(jī)制提供依據(jù)。 [研究方法] 本研究包括以下3部分： 1.精子頂體酶抑制劑篩選模型的建立：通過改良Kennedy法,以BAPNA為底物,頂體酶水解其酰胺鍵,生成發(fā)光基團(tuán),酶標(biāo)儀能檢測此基團(tuán)的吸光度,從而

3、計(jì)算頂體酶活性,以此原理建立頂體酶抑制劑篩選模型。對68種化合物進(jìn)行篩選,以期篩出2種活性較強(qiáng)的化合物。陽性對照組使用經(jīng)典頂體酶抑制劑TLCK和KF-950。 2.對精子超微結(jié)構(gòu)和精子-半透明帶結(jié)合試驗(yàn)的影響：配制不同濃度梯度的頂體酶抑制劑分別與精子作用,電鏡下觀察精子超微結(jié)構(gòu)變化。選用試管嬰兒實(shí)驗(yàn)室中,因男性因素受精失敗的卵細(xì)胞和健康可生育男性的精子作為研究對象。在解剖顯微鏡下將卵細(xì)胞透明帶剝離,并平分為兩部分。與經(jīng)頂體酶抑制

4、劑作用后的精子置于二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4h,顯微鏡下觀察粘附透明帶的精子數(shù)量。 3.大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：以SD年輕雄性大鼠(6～8w齡,體重200～250g)為研究對象,將不同濃度梯度的精子頂體酶抑制劑配成懸浮液,灌胃大鼠,每7d稱重1次。灌胃7w后解剖雄鼠,檢測其精子頂體酶活性及血清FSH、LH、T水平。同時取其睪丸、附睪及前列腺稱重,計(jì)算其臟器系數(shù)。 [結(jié)果] 1.精子頂體酶抑制劑篩選模型的建立：通過改良Kenned

5、y法,以BAPNA為底物建立了頂體酶抑制劑篩選模型,由68種化合物中篩選出2種抑酶活性強(qiáng),性質(zhì)穩(wěn)定的化合物4M-2434和GS-0122。殘余精子頂體酶活性與頂體酶抑制劑濃度呈負(fù)相關(guān)；4M-2434濃度為0.9μmol/mL時,7.5×106個精子的頂體酶被完全抑制；GS-0122濃度為2μmol/mL時,7.5×106個精子的頂體酶被完全抑制。其抑制精子頂體酶的能力比經(jīng)典頂體酶抑制劑TLCK分別高約400倍和200倍。 2.對

6、精子超微結(jié)構(gòu)和精子一半透明帶結(jié)合試驗(yàn)的影響：電鏡下精子超微結(jié)構(gòu)隨頂體酶抑制劑濃度增加,其異常程度增加,尤其以頂體部分為明顯；精子一半透明帶結(jié)合試驗(yàn)表明,精子穿透透明帶的能力與精子頂體酶抑制劑的濃度呈負(fù)相關(guān)。頂體酶抑制劑4M-2434濃度為0.9μmol/mL,GS-0122濃度為2μmol/mL時,精子穿透明帶數(shù)為0。與活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合。 3.大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：灌胃過程中,4M-24343個濃度組大鼠體重增加幅度小于GS-01223

7、個濃度組(P<0.05)。灌胃5w后檢測頂體酶活性,兩種化合物各濃度組大鼠精子頂體酶活性與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)。灌胃5w、7w后分別檢測雄鼠血清中FSH、LH和T,與對照組無明顯差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組大鼠性器官未見明顯改變。 [結(jié)論] 1.精子頂體酶抑制劑篩選模型的建立：通過改良Kennedy法,依據(jù)BAPNA與胰蛋白酶類的反應(yīng)原理,可建立頂體酶抑制劑活性篩選模型。以此為基礎(chǔ)篩選出的2種精子頂體酶抑制劑2,4-二氯苯基

8、咪唑基-3,4-二氯醇醚(4M-2434)和胍基取代雜環(huán)噻唑磺酰胺(GS-0122),抑酶活性比經(jīng)典項(xiàng)體酶抑制劑TLCK分別強(qiáng)約400倍和200倍。 2.對精子超微結(jié)構(gòu)和精子一半透明帶結(jié)合試驗(yàn)的影響：精子頂體酶抑制劑對精子形態(tài)尤其是頂體部分的超微結(jié)構(gòu)有破壞作用,而對精子尾部影響不明顯。其能夠高效抑制精子頂體酶活性,阻止精子和透明帶的結(jié)合。 3.大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：4M-2434和GS-0122兩種化合物動物實(shí)驗(yàn)表明,口服精子頂