豬CYP3A22和CYP3A46催化T-2毒素羥化代謝的關鍵位點鑒定.pdf

1、細胞色素P450氧化酶（Cytochrome P450，CYP）是由一類與結構和功能相關的同工酶構成的亞鐵血紅素—硫醇鹽蛋白超家族，廣泛存在于自然界的生物體中。它參與內(nèi)源性物質(zhì)的氧化、過氧化以及還原代謝作用和包括臨床上90％的藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝。
　　T-2毒素是單端孢霉烯族化合物中性質(zhì)最穩(wěn)定、毒性最強的毒素之一，廣泛分布于玉米、小麥和食品添加劑中。喂食被T-2毒素污染的飼料能使畜禽中毒，嚴重者甚至死亡。毒素在

2、畜禽體內(nèi)的代謝物可以通過農(nóng)副產(chǎn)品間接威脅到人類的健康。而豬是我國農(nóng)場和消費市場占有量最大的動物之一，它更容易受到T-2毒素的污染和毒害。
　　羥化反應是T-2毒素在動物體內(nèi)發(fā)生的主要代謝反應之一，也是影響其毒性大小的關鍵反應之一。前期的研究發(fā)現(xiàn)，在豬體內(nèi)，CYP3A家族基因（CYP3A22、CYP3A46和CYP3A29）能催化T-2毒素或HT-2毒素發(fā)生羥化反應。其中CYP3A29催化T-2毒素羥化代謝成3’-OH-T-2的關鍵

3、位點已經(jīng)初步闡明，然而CYP3A22和CYP3A46的羥化代謝T-2毒素的關鍵位點尚不清楚。
　　目的和手段：本研究將通過異源表達、純化、計算機同源建模、分子對接、定點突變和活性檢測等方法，在體外獲得天然構象、穩(wěn)定活性的豬的CYP3A家族蛋白的基礎上，特別是對CYP3A22和CYP3A46催化T-2毒素羥化代謝中的關鍵位點進行深入研究。
　　結果：
　　1、通過不同異源表達體系的摸索和優(yōu)化，最終在體外哺乳動物細胞表達體

4、系中獲得了具有穩(wěn)定催化T-2毒素羥化代謝能力的豬CYP3A家族蛋白；
　　2、在豬CYP3A家族與T-2毒素分子對接的實驗中，初步篩選出CYP3A22可能發(fā)揮羥化代謝的關鍵位點為Met-57、Arg-105、Arg-106、Ser-119、Arg-212、Phe-213、Asp-214、Phe-215、Ala-305、ILe-301、Thr-309、ILe-369、Ala-370、Ala-371、Arg-372、GLy-481和I

5、le-483這17個殘基，其中Phe-213、Thr-309和Gly-4813個殘基多次與T-2毒素分子形成氫鍵。CYP3A46可能發(fā)揮羥化代謝的關鍵位點為Phe-108、Phe-304、Pro-371、Ala-305、Thr-370、Lys-212、Phe-215、Phe-213、Arg-372、Arg-106、Arg-105、Glu-374和Leu-373這13個殘基，其中Lys-215、Phe-213和Glu-3743個殘基多次與

6、T-2毒素分子形成氫鍵。
　　3、對豬 CYP3A46催化 T-2毒素羥化代謝中的關鍵位點進行深入研究，發(fā)現(xiàn)F213A、F215A和E374A突變體羥化代謝T-2毒素能力喪失；R106A、F108A和T370A這三個突變體代謝能力下降非常顯著；突變體 K212A代謝產(chǎn)物量也有減少，約為野生型的75%。以上結果提示Arg-106、Phe-108、Phe-213、Phe-215、Thr-370和Glu-374是影響T-2毒素羥化代謝的