干擾素對(duì)豬肝臟關(guān)鍵藥物代謝酶CYP3A29的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450酶(cytochromeP450，CYP450)是機(jī)體重要的藥物代謝酶，涉及內(nèi)源性和外源性物質(zhì)以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝。另一方面，內(nèi)源性、外源性化合物也能夠誘導(dǎo)或抑制CYP450的表達(dá)，而嚴(yán)重影響著藥物的代謝、療效和安全性。CYP3A29是豬體內(nèi)最重要最豐富的藥物代謝酶之一，是人重要藥物代謝酶CYP3A4的研究模型。干擾素(Interferon，IFN)作為新型生物藥物已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床及獸醫(yī)臨床，使用過(guò)程中

2、通常需要與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用，以達(dá)到更好的效果，但其對(duì)機(jī)體藥物代謝酶的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，由此導(dǎo)致的藥物代謝酶的表達(dá)及活性的變化嚴(yán)重影響著對(duì)藥物的代謝、療效和安全性，經(jīng)常導(dǎo)致藥效降低、產(chǎn)生毒副反應(yīng)及藥物殘留，給臨床合理用藥帶來(lái)了很大困難，既造成了藥物的浪費(fèi)，又嚴(yán)重影響人和動(dòng)物的健康。因此研究干擾素對(duì)豬CYP3A29表達(dá)調(diào)控的影響及其機(jī)制的調(diào)節(jié)，既能指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥，又能為醫(yī)學(xué)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。本研究從細(xì)胞水平及動(dòng)物活體水平研究了

3、干擾素對(duì)CYP3A29表達(dá)的影響，并探討了其分子機(jī)制，取得的結(jié)果如下:
　　1.IFN-α與IFN-γ在細(xì)胞水平對(duì)CYP3A29表達(dá)的影響
　　分離制備豬肝原代細(xì)胞，MTT還原法分別檢測(cè)IFN-α與IFN-γ對(duì)豬肝細(xì)胞活性影響，證實(shí)IFN-α與IFN-γ對(duì)其無(wú)細(xì)胞毒性作用;分別用不同劑量IFN-α與IFN-γ在不同時(shí)間點(diǎn)處理豬原代肝細(xì)胞和傳代肝細(xì)胞HepLi，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westen-blot檢測(cè)肝細(xì)胞的CYP3

4、A29在mRNA水平和蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果表明IFN-α與IFN-γ均能顯著上調(diào)CYP3A29表達(dá)，且具有一定的時(shí)間、劑量相關(guān)性。
　　2.IFN-α與IFN-γ在動(dòng)物活體水平對(duì)CYP3A29表達(dá)及酶活性的影響
　　分別用IFN-α與IFN-γ肌肉注射30日齡仔豬，采用差速離法(Differentialcelltrifugationmethod)制備豬肝微粒體。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westen-blot測(cè)定CYP3A29m

5、RNA和蛋白質(zhì)水平變化，結(jié)果表明IFN-α與IFN-γ均能顯著上調(diào)CYP3A29表達(dá)，且與細(xì)胞水平相一致;以人CYP3A4的特異性底物硝苯地平作為探針，尼群地平作為內(nèi)標(biāo)，用高效液相色譜法測(cè)定硝苯地平氧化代謝產(chǎn)物氧化型硝苯地平含量，分析CYP3A29酶活性變化，表明豬CYP3A29基因與人CYP3A4基因一致，具有硝苯地平氧化代謝活性，且IFN-α與IFN-γ能激活CYP3A29酶代謝活性。
　　3.IFN-α與IFN-γ對(duì)孕烷受體

6、PXR表達(dá)的影響
　　分別用不同劑量IFN-α與IFN-γ在不同時(shí)間點(diǎn)處理豬原代肝細(xì)胞和傳代肝細(xì)胞HepLi，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westen-blot檢測(cè)PXR在mRNA水平和蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果表明IFN-α與IFN-γ均能顯著上調(diào)PXR表達(dá)，且與CYP3A29的表達(dá)具有一致性;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣品熒光定量PCR和Westen-blot檢測(cè)結(jié)果與細(xì)胞水平檢測(cè)結(jié)果相一致。
　　4.IFN-α與IFN-γ對(duì)CYP3A29表達(dá)調(diào)控機(jī)

7、制
　　分別構(gòu)建PXR真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-PXR及6個(gè)CYP3A29不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒;在MTT還原法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB對(duì)豬肝細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性作用基礎(chǔ)上，通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制試驗(yàn)確定肝臟藥物代謝酶CYP3A29的啟動(dòng)子在IFN-α與IFN-γ調(diào)控中的作用，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染PXR真核表達(dá)質(zhì)粒和siPXR使核受體PXR超表達(dá)或者沉默，轉(zhuǎn)染不同長(zhǎng)度的CYP3A29啟動(dòng)子片段，探討IFN-α與IFN-γ上調(diào)CYP3A29表達(dá)的分

8、子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)IFN-α與IFN-γ通過(guò)激活CYP3A29啟動(dòng)子上調(diào)CYP3A29的表達(dá)，IFN-α與IFN-γ激活CYP3A29轉(zhuǎn)錄部位是位于轉(zhuǎn)錄起始上游-1473至-1021區(qū)域;(2)IFN-α與IFN-γ處理細(xì)胞后，PXRmRNA上調(diào)先于CYP3A29mRNA發(fā)生，推斷PXR作為轉(zhuǎn)錄因子參與激活CYP3A29表達(dá);(3)PXR超表達(dá)試驗(yàn)和RNA干擾試驗(yàn)表明IFN-α與IFN-γ激活CYP3A29的表達(dá)與核受體PXR