穩(wěn)定表達人CYP3A4基因與Bama小型豬CYP3A基因的HepG-,2-細胞株的建立及探針藥物代謝表征的比較研究.pdf

1、一、研究背景: 人CYP3A在肝腸中表達最為豐富，約占CYP450總量的30％-40％，底物譜廣，并可分成CYP3A4、CYP33A5、CYP33A7和CYP3A43四種亞型，其中CYP3A4在成年個體的肝和腸中表達最多，占肝CYPs的30％和腸CYPs的70％，參與了60％現(xiàn)有臨床藥物的代謝。 新藥臨床前評價過程中需要其代謝相關(guān)數(shù)據(jù)。為獲得可反映人體藥物代謝概貌的最佳實驗動物模型，通過對不同種屬動物肝微粒體的比較研究發(fā)

2、現(xiàn)，狗適合作為CYP2D代謝途徑的動物模型；靈長類是最合適的CYP2C亞家族動物模型，而小型豬的CYP1A、CYP2A、CYP3A與人類極為相似，且該動物體型較小、易于操作和較小的底物需求量，是人類CYP3A藥物評價的最佳模型動物。 目前研究認為小型豬CYP3A亞家族蛋白共有4種亞型，即CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88，其中CYP3A29具有典型的硝苯地平和睪酮6β-羥基化活性（人CYP3A4和3A

3、5的特異活性），被苯巴比妥、利福平和地塞米松誘導(dǎo)的活性，及對酮康唑和醋竹桃霉素抑制的敏感性。因此，除靈長類和狗以外，小型豬成為唯一被FDA推薦的臨床前大動物實驗動物，在藥物研發(fā)、生產(chǎn)和監(jiān)管等領(lǐng)域越來越多地用于狗的替代模型動物。二、研究內(nèi)容和結(jié)果: 1.人CYP3A4基因和Bama小型豬CYP3A基因的克隆 用總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得目的基因，并將目的基因亞克隆至pMD-19-T上，測序確認獲得了人CYP3A4，以及小

4、型豬的CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88共5個基因；其中人CYP3A4、小型豬CYP3A39和CYP3A88與GeneBank中公布的序列完全一致；CYP3A29基因與NCBI記錄的CYP3A29基因序列（GENE ID：403324）有2個堿基不同，即G96A、T105A，但其編碼相同的CYP3A29的氨基酸酸序列（NP_999588）；但獲得的CYP3A22基因與GeneBank中公開的基因序列（AB00

5、6010.1）有6個堿基不同，即G36 C、A169 G、C546 T、A612 C、C1329 T和A1351 G，將該序列推定的蛋白質(zhì)氨基酸序列與CYP3A22（BAD06180.1）進行比對發(fā)現(xiàn)有3個氨基酸差異，即W12 C、W57 V、N451 D，且對來自5頭小型豬的基因經(jīng)過PCR擴增后測序結(jié)果完全一致，故此序列可能為Bama小型豬特有。 2.穩(wěn)定表達人CYP3A4基因和Bama小型豬CYP3A基因HepG2細胞株的建

6、立及探針藥物代謝鑒定 將克隆載體pMD-19-T上人CYP3A4和小型豬CYP3A系列的基因，在其5'和端3'插入酶切位點，并在3'插入6個組氨酸核苷酸序列，克隆至表達載體pcDNA3.1上，分別測序確認；將表達載體經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HepG2細胞，經(jīng)10代抗性篩選及RT-PCR、West-blot檢測表明本研究成功建立了所需CYP3A基因在HepG2中的穩(wěn)定表達體系；以人CYP3A的特異性底物硝苯地平和睪酮為探針鑒定重組細胞的藥物

7、代謝活性，結(jié)果表明所得人CYP3A4和小型豬CYP3A基因HepG2穩(wěn)定表達株具有硝苯地平氧化代謝和睪酮6β-羥基化活性。 3.穩(wěn)定表達人CYP3A4基因和Bama小型豬CYP3A基因HepG2細胞微粒體對探針藥物的代謝表征分析 以硝苯地平和睪酮作為探針底物，酮康唑作為抑制劑進行體外藥物代謝的動力學(xué)分析，結(jié)果如下。 （1）人CYP3A4與Bama小型豬CYP3A重組細胞中微粒體對硝苯地平的體外代謝符合米氏動力學(xué)特

8、征，其中CYP3A4、CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88的Vmax分別為1.62、1.27、1.72、1.22和1.63nmol/min/mg，Km分別為12.12、18.98、12.83、18.42和12.46μM，內(nèi)在清除率（Clint=Vm/Km）分別為133.66、66.91、134.06、66.23和130.29μL/min/mg。這些數(shù)據(jù)表明，CYP3A29和CYP3A88與CYP3A4的代謝特征

9、極為相似，而CYP3A22和CYP3A39與CYP3A4的硝苯地平代謝差異較大。 （2）重組細胞微粒體代謝睪酮符合Hill動力學(xué)特征，CYP3A4、CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88的Hill系數(shù)分別為1.14、1.61、1.34、1.62和1.35，說明本實驗獲得的重組CYP3A酶對睪酮的代謝均屬于正協(xié)同作用；Vmax分別為7.13、4.34、6.21、4.15和6.08nmol/min/mg，S5

10、0分別為41.87、73.64、50.08、69.76和50.24μM mol/L，Clint（Vm/S50）分別為172.06、58.90、124.0、59.49和121.03μL/min/mg，表明在對睪酮的6β-羥基化代謝中CYP3A4、CYP3A29和CYP3A88的酶作用效能比較接近。 （3）本實驗獲得酮康唑?qū)ο醣降仄酱x反應(yīng)抑制的IC50值，CYP3A4、CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39分別為0.132

11、、0.233、0.090、0.262、0.104μM；對睪酮的代謝的IC50值分別為0.032、0.0688、0.0562、0.077和0.065μM，這些數(shù)據(jù)表明酮康唑不論對硝苯地平或睪酮的代謝，其對CYP3A4、CYP3A29和CYP3A88抑制活性均較近。 4.穩(wěn)定表達人CYP3A4基因和Bama小型豬CYP3A基因穩(wěn)定表達HepG2全細胞對探針藥物的代謝表征分析 用基因重組全細胞體外孵育的方法，比較小型豬HepG

12、2-CYP3A與人HepG2-CYP3A4的硝苯地平、睪酮和酮康唑代謝表征，其結(jié)果如下。 （1）重組全細胞的硝苯地平體外孵育代謝符合米氏動力學(xué)特征，HepG2-CYP3A4、HepG2-CYP3A22、HepG2-CYP3A29、HepG2-CYP3A39和HepG2-CYP3A88的酶動力學(xué)參數(shù)，Vmax分別為2.21、1.52、2.51、1.40和2.46nmol/min/mg，Km分別為16.77、20.51、15.47、

13、21.93和15.56μM，其內(nèi)源性清除率Clint分別為131.78、74.11、162.25、63.84和157.97μL/min/mg，這些數(shù)據(jù)表明重組全細胞的硝苯地平代謝特征與微粒體實驗類似，CYP3A29和CYP3A88對硝苯地平的代謝動力學(xué)特征與CYP3A4的代謝特征近似。 （2）重組全細胞的睪酮體外孵育代謝符合Hill動力學(xué)特征，HepG2-CYP3A4、HepG2-CYP3A22、HepG2-CYP3A29、He

14、pG2-CYP3A39和HepG2-CYP3A88的酶動力學(xué)參數(shù)，Vmax分別為2.55、1.83、2.37、1.72和2.39 nmol/min/mg，Km分別為14.14、23.66、16.88、21.48和17.81μM，內(nèi)源性清除率（Clint）180.40、77.59、140.36、93.20和134.40μL/min/mg，這些數(shù)據(jù)表明HepG2-CYP3A4與HepG2-CYP3A29和HepG2-CYP3A88代謝特征較

15、為相似，而與HepG2-CYP3A22和HepG2-CYP3A39的差別較大。 （3）重組全細胞酮康唑?qū)ο醣降仄酱x的IC50值，HepG2-CYP3A4、HepG2-CYP3A22、HepG2-CYP3A29、HepG2-CYP3A39和HepG2-CYP3A88，分別為0.539、0.8785、0.4985、0.8787和0.556μM；對睪酮的IC50值分別為0.120、0.207、0.125、0.229和0.128μM，

16、這些數(shù)據(jù)表明酮康唑?qū)epG2-CYP3A4、HepG2-CYP3A29和HepG2-CYP3A88的睪酮代謝的抑制均較近，且顯著高于對CYP3A22和CYP3A39的抑制活性。 5.結(jié)論: 通過對人CYP3A4基因和Bama小型豬CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A88基因重組細胞的微粒體和全細胞的CYP3A特異性探針底物的硝苯地平和睪酮代謝活性，以及CYP3A的特異性抑制劑的體外孵育實驗表明，人