抗EGFR單鏈抗體與力達(dá)霉素融合蛋白的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文抗EGFR單鏈抗體與力達(dá)霉素融合蛋白的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究姓名：盛唯瑾申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)指導(dǎo)教師：甄永蘇李電東20090601北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文中文摘要2抗EGFR單鏈抗體與力達(dá)霉素輔基蛋白融合蛋白ER(FvLDP)的構(gòu)建及活性分析利用基因重組技術(shù)將篩選出來的EGFR高親和力單鏈抗體片段基因連接到含有力達(dá)霉素輔基蛋白基因的重組質(zhì)粒pET30(a)LDP，構(gòu)建重組質(zhì)粒

2、pET30(a)scFvLDP，轉(zhuǎn)化到EcoliBL21(DE3)staroM中，IPTG誘導(dǎo)帶有組氨酸標(biāo)簽肽(Histag)的融合蛋白的表達(dá)。融合蛋白分子量約為38kDa，主要以包涵體形式存在。Ni離子親和柱純化融合蛋白，蛋白收獲量約為5mg／L。ELISA檢測及細(xì)胞免疫熒光顯示融合蛋白與純EGFR抗原的相對親和力為80x10一M，對EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的親和力明顯高于低表達(dá)的正常細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明融合蛋白可引起細(xì)胞周期

3、的G2／M期阻滯，且這種抑制作用存在著一定的劑量依賴關(guān)系。細(xì)胞增殖實驗證明融合蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其對EGFR高表達(dá)的A431和A549細(xì)胞的殺傷作用明顯強(qiáng)于EGFR低表達(dá)的HEK293細(xì)胞。體內(nèi)抑瘤實驗表明融合蛋白能夠顯著抑制人鱗狀上皮癌A431裸鼠移植瘤的生長，且毒副作用較小。融合蛋白05mg&g和5mg&g2個劑量組35天的抑瘤率分別為514％署t1675％，與對照組和LDP組相比有顯著差異。3抗EGFR單鏈抗體與力達(dá)霉素強(qiáng)

4、化融合蛋白ER(FvLDPAE)的制備及活性分析將抗EGFR單鏈抗體與力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白與力達(dá)霉素活性發(fā)色團(tuán)組裝，得到強(qiáng)化融合蛋白。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明強(qiáng)化融合蛋白可引起細(xì)胞周期的G2／M期阻滯，且這種抑制作用存在著一定的劑量依賴關(guān)系。Hoechst染色顯示強(qiáng)化融合蛋白可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞增殖實驗證明強(qiáng)化融合蛋白對腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)殺傷作用，且強(qiáng)化融合蛋白作用要明顯強(qiáng)于單純的LDM，其作用于EGFR高表達(dá)的A43l和A54

5、9細(xì)胞的Ic50值分別是LDM的1／7和1／10。體內(nèi)抑瘤實驗表明強(qiáng)化融合蛋白對人鱗狀上皮癌A431裸鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，且毒副作用較LDM小。強(qiáng)化融合蛋白02mg／kg和03mg／kg2個劑量組30天抑瘤率分別為754％和813％，與LDM組相比存在顯著差異。強(qiáng)化融合蛋白可以引起細(xì)胞周期G2／M阻滯，對EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的體外殺傷活性，對人鱗狀上皮癌A431裸鼠移植瘤有顯著的抑制作用，有望成為一種具有良好應(yīng)用前景的