細胞穿透肽(Arg)-,9-與力達霉素強化融合蛋白的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、力達霉素（Lidamycin，LDM，C-1027）是由球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）產(chǎn)生的烯二炔類抗生素，是迄今報道過的對腫瘤細胞殺傷作用最強的大分子肽類抗腫瘤抗生素，具有很強的細胞毒性、抗血管生成活性及抑制實驗?zāi)[瘤生長的作用。LDM的分子由烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團（AE）和輔基蛋白（LDP）構(gòu)成，兩者可進行拆分和重建，以往的研究表明發(fā)色團是力達霉素分子的活性部分，輔基蛋白具有穩(wěn)定和保護發(fā)色團的功能。輔基蛋白

2、是否具有抗腫瘤活性，目前還沒有定論。
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，是高度血管化的血管生成依賴性生長的人類腫瘤。目前的報道表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤的血管微環(huán)境在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展、侵襲、臨床診斷及治療效果中起關(guān)健性作用。由于血腦屏障的存在，限制了大部分抗血管生成藥物在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療方面的應(yīng)用。
　　 細胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）是一類以非受體依賴方式、非經(jīng)典內(nèi)吞方式直接穿過

3、細胞膜進入細胞的多肽，它們的長度一般不超過30個氨基酸且富含堿性氨基酸，能夠介導(dǎo)與其相連的各種本不能通過細胞膜的生物活性物質(zhì)進入細胞。迄今的研究提示CPPs能在體外或體內(nèi)介導(dǎo)一系列生物活性分子如蛋白質(zhì)、肽類、寡聚核苷酸、質(zhì)粒及脂質(zhì)體等進入各種不同組織和細胞，這些重要發(fā)現(xiàn)為將親水性蛋白、寡肽及寡核苷酸應(yīng)用于藥學(xué)、基因治療、細胞生物學(xué)等研究領(lǐng)域開辟了一條新的道路。
　　 本研究利用本室構(gòu)建表達的力達霉素重組輔基蛋白rLDP，研究其對

4、多種腫瘤細胞的體外親和活性及其體內(nèi)外抗腫瘤活性，通過分子重建制備重組力達霉素（rLDM），研究其與正常力達霉素的結(jié)構(gòu)和活性異同；利用基因工程方法構(gòu)建表達輔基蛋白與細胞穿透肽（Arg）9的融合蛋白（Arg）9-LDP，對其穿膜能力和抗腫瘤活性進行研究，再通過分子強化技術(shù)組裝發(fā)色團AE，得到強化融合蛋白（Arg）9-LDP-AE，研究其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的體外殺傷作用以及體內(nèi)抑瘤活性。
　　 1.重組力達霉素的制備及活性分析
　

5、　 利用本室保存的含有pET30-sldp坳質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）starTM菌株，IPTG誘導(dǎo)帶有組氨酸標簽肽（His-tag）的重組輔基蛋白的表達。重組輔基蛋白rLDP分子量約為12 kDa，除存在于周質(zhì)腔中外，還分泌到培養(yǎng)液上清中。Ni2+親和層析對培養(yǎng)液上清的蛋白進行純化，得到的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測純度在98％以上，每升發(fā)酵液得到23 mg活性蛋白。細胞免疫熒光和基于流式細胞術(shù)的熒光實驗結(jié)果顯示r

6、LDP蛋白對腫瘤細胞，如人肺癌A549細胞、人卵巢癌OVCAR3細胞、人肝癌Be1-7402細胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞、人非小細胞肺癌H460細胞均有很強的結(jié)合活性，而對正常肝組織來源的LO2細胞則無親和活性。細胞增殖實驗證明rLDP蛋白可抑制Be1-7402細胞的增殖。流式細胞儀檢測結(jié)果表明rLDP蛋白可引起B(yǎng)e1-7402細胞周期的G2/M期阻滯，且存在濃度依賴性。體內(nèi)抑瘤實驗表明rLDP蛋白能夠顯著抑制小鼠肝癌H22移植瘤的生長

7、，且毒副作用較小。rLDP蛋白靜脈注射15 mg/kg、30 mg/kg和60 mg/kg3個劑量組11天的抑瘤率分別為44.6％、57.1％和50.1％，與對照組相比有顯著差異；rLDP蛋白腹腔注射30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg3個劑量組11天的抑瘤率分別為52.1％、49.3％和59.5％，與對照組相比有顯著差異：rLDP蛋白灌胃給藥30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg3個劑量組11天的抑瘤

8、率分別為34.3％、30.2％和60.3％，與對照組相比有顯著差異。將AE分子與rLDP蛋白在體外進行分子組裝后，經(jīng)HPLC檢測在350 nm處出現(xiàn)了特定的吸收峰，表明AE分子與rLDP蛋白進行了成功組裝，得到了重組力達霉素rLDM。MTT試驗結(jié)果顯示重組力達霉素rLDM對不同的腫瘤細胞系均表現(xiàn)出了強烈的殺傷作用，其對L187細胞、MCF-7細胞、SKOV3細胞和Be1-7402細胞的IC50值與力達霉素LDM接近。流式細胞儀檢測結(jié)果表

9、明rLDM和LDM在濃度為1 nM時引起U87細胞和SKOV3細胞周期的S期阻滯和G2/M期阻滯，在濃度為0.001 nM時SKOV3細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，L187細胞出現(xiàn)G1期阻滯。
　　 2.細胞穿透肽（Arg）9與力達霉素融合蛋白（Arg）9-LDP的構(gòu)建及活性分析
　　 利用基因重組技術(shù)擴增含有細胞穿透肽（Arg）9和力達霉素輔基蛋白LDP基因的（arg）9ldp片段，連接到質(zhì)粒pET30a（+）上，構(gòu)建重組質(zhì)

10、粒pET30-（arg）9ldp，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）starTM中，IPTG誘導(dǎo)帶有組氨酸標簽肽（His-tag）的融合蛋白的表達。融合蛋白分子量約為15 kDa，主要以包涵體形式存在。Ni2+親和柱純化融合蛋白，得到的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測純度在95％以上，每升發(fā)酵液得到15 mg活性蛋白。細胞熒光檢測和基于流式細胞術(shù)的熒光實驗結(jié)果顯示帶有穿透肽的融合蛋白可以穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部，與重組輔基蛋白和牛血

11、清白蛋白相比有明顯差異，其在37℃的穿透能力優(yōu)于4℃，說明穿透過程與能量有關(guān)。細胞增殖實驗證明融合蛋白可抑制腫瘤細胞的增殖，其對U87細胞的IC50值為5.25×10-5mol/L。流式細胞儀檢測結(jié)果表明20μM的融合蛋白可引起U87細胞周期的G1期阻滯，濃度為200μM時引起U87細胞周期的G2/M期阻滯和S期阻滯。
　　 3.細胞穿透肽（Arg）9與力達霉素強化融合蛋白（Arg）9-LDP-AE的制備及活性分析
　　

12、 將含有細胞穿透肽和力達霉素輔基蛋白的融合蛋白（Arg）9-LDP與力達霉素活性發(fā)色團組裝，經(jīng)HPLC檢測在350 nm處出現(xiàn)了特定的吸收峰，表明強化融合蛋白（Arg）9-LDP-AE組裝成功。細胞增殖實驗證明強化融合蛋白對腫瘤細胞具有強殺傷作用，強化融合蛋白和力達霉素對U87細胞和MCF-7細胞的IC50值相近，強化融合蛋白對OVCAR3細胞和Be1-7402細胞的IC50值分別是力達霉素的1/20和1/10。流式細胞儀檢測結(jié)果表明強

13、化融合蛋白可引起U87細胞周期的G2/M期阻滯和S期阻滯，Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細胞儀結(jié)果表明強化融合蛋白以劑量依賴方式誘導(dǎo)細胞凋亡。體內(nèi)抑瘤實驗表明強化融合蛋白（Arg）9-LDP-AE對肝癌H22小鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，且毒副作用較LDM小。強化融合蛋白0.2 mg/kg和0.3 mg/kg劑量組抑瘤率分別為85.3％和89.2％，與LDM0.05 mg/kg組相比有明顯提高。（Arg）9-LDP-AE