單鏈抗體、RGD與力達(dá)霉素在鏈霉菌中的融合表達(dá)研究暨多靶點(diǎn)RNA聯(lián)合干擾在腫瘤治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：?jiǎn)捂溈贵w、RGD與力達(dá)霉素在鏈霉菌中的融合表達(dá)研究
　　 力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)是由球孢鏈霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)產(chǎn)生的抗腫瘤抗生素。LDM分子由兩部分組成:一為烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(Lida-chromophore，LDC)，具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒作用但不穩(wěn)定；一為110個(gè)氨基酸殘基組成的輔基蛋白(Lida-prote

2、in，LDP)，對(duì)LDC的穩(wěn)定起保護(hù)作用。發(fā)色團(tuán)與輔基蛋白以非共價(jià)鍵結(jié)合，其結(jié)合具有特異性和穩(wěn)定性。LDM生物合成基因簇包括約75kbDNA中的56個(gè)開放閱讀框(ORF)，其中輔LDP編碼基因cagA位于ORFA1與ORFA4之間。
　　 單克隆抗體與化療藥物偶聯(lián)物是腫瘤靶向治療藥物的一個(gè)重要分支。特定的化療藥物與不同抗體偶聯(lián)可以作為一種技術(shù)平臺(tái)制備系列化的抗體藥物?？笽V型膠原酶單抗及其單鏈抗體(single-chain Fv

3、fragment，scFv)可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。LDM是迄今已報(bào)道的對(duì)腫瘤細(xì)胞具有最強(qiáng)殺傷作用的抗腫瘤抗生素，可以作為單抗導(dǎo)向藥物的“彈頭”。本實(shí)驗(yàn)室已將LDP與抗IV型膠原酶scFv在大腸桿菌中成功進(jìn)行融合并表達(dá)scFv-LDP，再裝配LDC，形成scFv-LDM融合蛋白。本研究嘗試以LDM原產(chǎn)生菌S.globisporusC-1027為基礎(chǔ)，通過遺傳重組構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)并分泌scFv-LDM的鏈霉菌重組菌株。其策略是利用同源

4、雙交換的方法，用cagA-scFv基因序列取代LDM生物合成基因簇中LDP編碼基因cagA，不改變LDM生物合成基因簇其他組分的編碼基因。
　　 首先使用PfuDNA聚合酶，以S.globisporus C-1027的總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，在輔基蛋白基因cagA終止密碼子TGA兩側(cè)擴(kuò)增出用于雙交換的兩臂--E臂和G臂；以含有scFv基因的pEFL質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增scFv基因；從質(zhì)粒pUO9090中酶切得到阿普霉素抗性基因

5、片段。將上述4個(gè)片段連入帶有硫鏈絲菌素抗性基因(tsr)，且可用于接合轉(zhuǎn)移的大腸桿菌菌一鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pBS03，最終得到用于同源雙交換的含融合蛋白編碼基因cagA-scFv的質(zhì)粒pBS-scFv。scFv基因序列連接在cagA的C末端終止密碼子之前，為了保持兩個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)的生物活性，在兩個(gè)基因之間用編碼GGGGS五肽的DNA序列連接。用構(gòu)建好的質(zhì)粒pBS-scFv轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567，通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入S。globisporu

6、sC-1027中，篩選有阿普霉素抗性而對(duì)硫鏈絲菌素敏感(AmrThioss)的轉(zhuǎn)化子，即可能為發(fā)生雙交換的重組菌株。
　　 對(duì)重組菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，Southernblot對(duì)重組菌株進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，重組菌株S.globisporusC-1027-scFv構(gòu)建完全正確，LDM生物合成基因簇中的LDP編碼基因cagA已經(jīng)被融合蛋白編碼基因cagA-scFv序列所取代。構(gòu)建成功的重組菌株被命名為S.globisp

7、orusC-1027-scFv。
　　 由于LDM的抗腫瘤活性和抑菌活性相互平行，本研究用抑菌活性來代替抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，重組菌株S.globisporusC-1027-scFv發(fā)酵產(chǎn)物具有抑菌活性。使用C1培養(yǎng)基對(duì)重組菌株不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)酵60小時(shí)后抑菌活性開始出現(xiàn)，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)活性逐漸增加，84小時(shí)達(dá)到頂峰，108小時(shí)后活性消失。
　　 SDS-PAGE分析顯示，重組菌株S.glo

8、bisporusC-1027-scFv不再產(chǎn)生LDM條帶。然而，檢測(cè)到一條新蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約38000道爾頓，位置與scFv-LDM融合蛋白分子量相對(duì)應(yīng)，而S.globisporusC-1027菌株中沒有檢測(cè)到該條帶。根據(jù)以上結(jié)果，推測(cè)該新蛋白條帶為scFv-LDM融合蛋白表達(dá)條帶。
　　 ELISA方法檢測(cè)了重組菌株發(fā)酵液抗IV型膠原酶的免疫活性，結(jié)果表明重組菌株發(fā)酵液具有IV型膠原酶結(jié)合活性。對(duì)活性發(fā)酵液樣品進(jìn)行We

9、sternblot檢測(cè)，結(jié)果顯示重組菌株發(fā)酵液在scFv-LDM融合蛋白位置顯色，進(jìn)一步證實(shí)發(fā)酵液中含有scFv-LDM融合蛋白。
　　 RGD三肽特異性與αvβ3整合素結(jié)合，而αvβ3整合素在很多腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤的血管形成高度相關(guān)。為了構(gòu)建力達(dá)霉素融合蛋白表達(dá)技術(shù)平臺(tái)，我們還開展了RGD-LDM融合蛋白的研究工作。根據(jù)含RGD十肽ACRGDMFGCA的氨酸酸序列和鏈霉菌偏好密碼子，合成十肽(tenpeptide，ten

10、p)基因序列，連接到cagA的C末端，構(gòu)建了含cagA-tenp基因序列可用于同源雙交換的質(zhì)粒pBSten。測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒pBSten經(jīng)接合轉(zhuǎn)整合到S.globisporus C-1027基因組中，根據(jù)抗性差異挑取重組子，進(jìn)行PCR驗(yàn)證和Southernblot驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的菌株命名為S.globisporus C-1027-tenp，抑菌圈檢測(cè)顯示重組菌株發(fā)酵液具有抑菌活性。
　　 綜上所述，我們成功構(gòu)建了重組菌株S.g

11、lobisporusC-1027-scFv和S。globisporusC-1027-tenp，重組菌株S.globisporusC-1027-scFv可以產(chǎn)生并分泌scFv-LDM，但該重組菌株scFv-LDM的產(chǎn)率有待進(jìn)一步提高。本研究為力達(dá)霉素融合蛋白表達(dá)技術(shù)平臺(tái)的建立打下了良好的基礎(chǔ)。
　　 第二部分：多靶點(diǎn)RNA聯(lián)合干擾在腫瘤治療中的應(yīng)用研究
　　 RNA干擾技術(shù)是一種非常有潛力的腫瘤基因治療手段，目前用于治療研

12、究的RNA干擾劑主要有化學(xué)合成小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)和短發(fā)夾RNA(shorthairpin RNA，shRNA)表達(dá)載體。為了實(shí)現(xiàn)多基因聯(lián)合干擾，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一個(gè)能同時(shí)表達(dá)多種shRNA的質(zhì)粒pCSH1。其優(yōu)點(diǎn)是分子量小，可以同時(shí)攜帶多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位，使DNA轉(zhuǎn)染時(shí)只需要較小的量就可以實(shí)現(xiàn)有效的RNA干擾作用，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的聯(lián)合抑制。
　　 癌基因N-ras和c-Myc

13、經(jīng)常在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)或突變。在人肝癌HepG2細(xì)胞中，N-ras和c-Myc同時(shí)異常表達(dá)。本研究以N-ras和c-Myc為靶點(diǎn)，將該基因中的shRNA模板序列串聯(lián)構(gòu)建到載體pCSH1中，構(gòu)建了能表達(dá)N-rasshRNA和c-MycshRNA的雙干擾載體pCSH1-NM，使該載體在導(dǎo)入HepG2細(xì)胞后即可同時(shí)抑制兩個(gè)基因的表達(dá)。
　　 以對(duì)照載體pCSH1-mock、N-ras干擾載體pCSH1-Nras、c-Myc干擾載體pC

14、SH1-cMyc和雙干擾載體pCSH1-NM分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR和Westernblot檢測(cè)。結(jié)果表明，雙干擾載體能同時(shí)抑制兩個(gè)基因的表達(dá)，每個(gè)基因的干擾都達(dá)到和單基因干擾載體同樣的抑制效果。
　　 生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同時(shí)干擾N-ras和c-Myc對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于單獨(dú)干擾N-ras或c-Myc。Hochest染色結(jié)果顯示，經(jīng)過pCSH1-NM質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染處理后，凋亡細(xì)胞比例增加，凋亡細(xì)胞百分比明顯高

15、于N-ras或c-Myc單獨(dú)干擾組。結(jié)果提示同時(shí)干擾N-ras和c-Myc能明顯增強(qiáng)凋亡誘導(dǎo)作用。pCSH1-Mock轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組結(jié)果基本一致，且細(xì)胞密度明顯高于pCSH1-Nras或pCSH1-cMyc單獨(dú)轉(zhuǎn)染組以及pCSH1-NM轉(zhuǎn)染組。這些結(jié)果說明，人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡主要是由N-ras或(和)c-Myc基因抑制引起的。
　　 基因芯片分析結(jié)果表明，N-ras單基因干擾引起的基因變化(顯著升高或降低)數(shù)明顯高于c

16、-Myc單基因干擾引起的基因表達(dá)變化數(shù)。N-ras與c-Myc雙干擾引起的基因表達(dá)變化數(shù)介于二者之間。3個(gè)促凋亡基因TSC22，GMF和NRIF3在pCSHl-NM組與pCSHI-cMyc同時(shí)上調(diào)，說明N-ras和c-Myc基因可促進(jìn)HepG2細(xì)胞調(diào)亡。
　　 綜上所述，HepG2細(xì)胞中異常表達(dá)的N-ras和c-Myc可以通過RNA干擾手段同時(shí)抑制，且N-ras和c-Myc雙基因干擾比N-ras或c-Myc單基因干擾在抑制細(xì)胞生