重組人N-端缺失脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān)蛋白（gapM1）的研制.pdf

1、脂肪組織是人體最大的能量儲存庫，在機(jī)體需要時(shí)動用儲存的脂肪，向機(jī)體供能。同時(shí)脂肪組織也是一個(gè)極其重要的內(nèi)分泌器官[1，2]。apMl(Adiposemostgenetranscript1)pJ就是由脂肪組織分泌的一種活性多肽，又名GBP28(gelatinbindingprotein28)[4]、adipoQIs]、adiponectin[6]、Acrp30(adipocytecomplementrelatedprotein30kD)[

2、7]等。apMl參與能量代謝、炎癥反應(yīng)等生理過程，與肥胖(obesny)、2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、心血管疾病(cardiovascularmsease／CVD)等疾病有密切的關(guān)系[8]。 人apMl由247個(gè)氨基酸組成，分子量為30kD。整個(gè)多肽鏈由四個(gè)部分組成[4]，包含氨基端的信號序列、可變區(qū)、膠原樣區(qū)和羧基端的球狀結(jié)構(gòu)域。血漿中ap

3、Ml的存在形式包括同源三聚體、六聚體和更多亞單位組成的更大的復(fù)合體形式[10-12]，以及由蛋白酶酶切產(chǎn)生的球狀結(jié)構(gòu)域單體形式。人apMl的N一端球狀結(jié)構(gòu)域(globulardomain0fapMl，gapMl)是其活性結(jié)構(gòu)域，是其發(fā)揮生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 動物實(shí)驗(yàn)證明gapMl可以降低血漿中FFA和TG的水平；降低血糖和改善機(jī)體的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。長期小劑量的注射重組的gapMl可以在不影響食欲的情況下降低體重。所以gapMl

4、將有可能被開發(fā)成具有降低血糖、血脂和減肥雙重功能的一類新藥。目前并沒有一種能夠高效制備gapMl的方法。國外也因?yàn)間apMl的制備不能滿足實(shí)驗(yàn)需要而退出三期臨床實(shí)驗(yàn)。 為了能夠簡單、快速、經(jīng)濟(jì)地大量制備gapMl，我們選擇巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)作為表達(dá)系統(tǒng)。巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)是近年來發(fā)展起來的一個(gè)十分有效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，廣泛用于外源蛋白的體外表達(dá)【13．15】。但是有一些外源蛋

5、白使用的部分密碼子不能被巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)蛋白翻譯系統(tǒng)有效識別和翻譯。需要將密碼子突變成巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)偏愛的密碼子，外源蛋白才能在巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)中得到有效的表達(dá)[16-181。 我們將gapMlcDNA中非畢赤酵母偏愛密碼子完全或部分同義突變?yōu)楫叧嘟湍?Pichiapastoris)偏愛的密碼子[19]，然后分別將二者和野生型人gapM

6、lcDNA克隆到pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)，其中只有非畢赤酵母偏愛密碼子部分同義突變的克隆實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，獲得了高效表達(dá)人gapMl的多拷貝轉(zhuǎn)化子。該轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平高，產(chǎn)物穩(wěn)定。 我們建立了鏈脲霉素誘導(dǎo)的C57／乩小鼠高血糖模型。實(shí)驗(yàn)證明rh—gapMl能夠明顯降低鏈脲霉素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的小鼠高血糖模型[20、21]的血糖水平。首先分別給予C57/B

7、L小鼠腹腔注射150mg/kgBWSTZ，特異性地破壞胰島B細(xì)胞，造成急性高血糖模型，選取空腹血糖大于16．6mm01／L者，共24只，分成生理鹽水組、rh-gapMl低劑量組(2．Sug／gBw)、rh—gapMl中劑量組(5．Oug／gBW)和rh—gapMl高劑量組(7．5ug／gBW)四組，每組各6只。尾靜脈取血測給藥前、后4h的空腹血糖值。結(jié)果顯示低劑量rh一gapMl(2．5ug／gBw)具有降低血糖的作用，而高劑量rh-g

8、apMl(7．5ug／gBw)可以將高血糖水平降至正常血糖水平。 我們利用30L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。工程菌對數(shù)生長18小時(shí)，菌密度OD60。達(dá)到150左右時(shí)，甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)30小時(shí)，菌密度可達(dá)到350。目的蛋白表達(dá)水平超過lOOmg／L。發(fā)酵上清脫鹽后，經(jīng)凝膠過濾、離子交換兩步純化，可以得到純度大于95％的th-gapMl。 我們利用巴氏畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)人源gapMl，工藝流程操作簡單、周期短、成本低，目的蛋白以可溶的活