1，25（OH）-,2-D-,3-對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的：腎臟纖維化包括腎小球硬化與腎間質(zhì)纖維化，是各種原發(fā)、繼發(fā)腎小球疾病和非腎小球疾病所致腎臟疾病終末期的共同表現(xiàn)。大量研究表明腎間質(zhì)纖維化程度對(duì)長(zhǎng)期腎功能來(lái)說(shuō)更為重要，因此腎間質(zhì)纖維化越來(lái)越多地受到人們的重視。如何防治腎間質(zhì)纖維化成為目前腎臟病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。作為抑制腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)因子的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)，目前在腎臟領(lǐng)域頗受重視。HGF在腎臟主要表達(dá)于腎間質(zhì)細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，

2、以內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌的形式特異性作用于靶細(xì)胞，發(fā)揮其對(duì)腎臟的保護(hù)作用。而BMP-7屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族，它不僅在腎臟的發(fā)生作用中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并且可以治療多種腎小管和腎間質(zhì)疾病。伴隨抑制纖維化因子而來(lái)的致纖維化因子TGF-β1的高表達(dá)參與腎間質(zhì)纖維化的各個(gè)步驟，其誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路激活是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal TransitionEMT)機(jī)制中最為重要的環(huán)節(jié)，抑制轉(zhuǎn)化

3、生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，可能是一種有效的防治纖維化的手段。1，25(OH)<,2>D<,3>作為維生素D(VitD)經(jīng)肝、腎代謝后的主要活性形式，具有很重要的生物學(xué)活性。在維持機(jī)體正常鈣磷代謝及骨的正常發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。然而，近年來(lái)隨著對(duì)1,25(OH)<,2>D<,3>的不斷研究，其腎臟保護(hù)作用已不僅僅局限于對(duì)血鈣、磷和PTH水平的調(diào)節(jié)，但其確切機(jī)制尚未明了，對(duì)于這種新機(jī)制的研究有助于重新評(píng)價(jià)1

4、，25(OH)<,2>D<,3>在治療腎臟病中的意義。單側(cè)輸尿管接扎(UUO)是一成熟的腎間質(zhì)纖維化模型，腎小球病變不明顯，本試驗(yàn)以此動(dòng)物模型為平臺(tái)，選用1，25(OH)<,2>D<,3>干預(yù)，通過(guò)觀察腎臟病理改變、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HGF、BMP-7、TGF-β1的表達(dá)變化，從細(xì)胞水平探討1，25(OH)<,2>D<,3>抗腎間質(zhì)纖維化，保護(hù)腎功能的機(jī)制。 方法：選擇清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠54只，體重(200±10)

5、克，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(A組)，輸尿管結(jié)扎組(UUO組即B組)，1，25(OH)<,2>D<,3>治療組(C組)，每組各18只。每組又因于術(shù)后第3、7、14天分批處死而分為N<,3>、N<,7>、N<,14>組，每組各6只。將各組大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左側(cè)輸尿管，在中上1/3處用4號(hào)線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管，以防逆行性感染，假手術(shù)組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其他手

6、術(shù)過(guò)程同前。術(shù)后各組大鼠均正常飲食。1，25(OH)<,2>D<,3>治療組大鼠以0.1 mL1，25(OH)<,2>D<,3>混懸液9ng/100g/d灌胃，1次/日；假手術(shù)組和UUO組大鼠用等量花生油灌胃，1次/日三組均于術(shù)前一天開始灌胃至術(shù)后第3天、第7天和第14天，分三批留取標(biāo)本。輸尿管結(jié)扎術(shù)后分別于第3、7、14天處死，大鼠處死前留取血標(biāo)本，檢測(cè)血清鈣(Ca)、磷(P)濃度，迅速取出左腎，按冠狀位縱形切開，取腎組織的1/2置于

7、10％福爾馬林固定液固定，酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明石蠟包埋，制成5um切片。光鏡HE、Masson染色觀察腎臟病理變化。采用免疫組織化學(xué)染色測(cè)定腎間質(zhì)BMP-7、HGF、TGF-β1的表達(dá)，結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：與A組相比，B組及C組的血Ca、P輕度升

8、高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。光鏡下觀察，HE及Masson染色A組未見(jiàn)異常，B組及C組各時(shí)相點(diǎn)大鼠腎臟腎小球無(wú)明顯變化。HE染色B組術(shù)后3天腎小管擴(kuò)張不明顯，間質(zhì)中少量單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)寬度增加；B組7天可見(jiàn)。腎小管擴(kuò)張明顯，上皮細(xì)胞變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見(jiàn)萎縮腎小管；B組14天上述病變加重，可見(jiàn)彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管基底膜不同程度斷裂，皮質(zhì)及外髓萎縮的腎小管較多，間質(zhì)中大量淋巴單

9、核細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化較明顯。Masson染色可見(jiàn)B組術(shù)后3天腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)寬度增加，膠原纖維增加，染色加深；此后，病變逐漸加重。C組與B組平行相比腎小管間質(zhì)病變程度明顯減輕，腎間質(zhì)相對(duì)面積明顯減少(P<0.01)。三組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：BMP-7在A組高度表達(dá)，腎臟髓質(zhì)區(qū)表達(dá)明顯高于皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)，主要分布于腎小管及腎間質(zhì)，在升支小管上皮、遠(yuǎn)曲小管、集合管均有表達(dá)，在直部及皮髓質(zhì)交界處染色最強(qiáng)，

10、近曲小管僅有少量表達(dá)，而在腎小球內(nèi)基本無(wú)表達(dá)。在B組各時(shí)相點(diǎn)BMP-7蛋白的表達(dá)隨時(shí)間呈進(jìn)行性下降，且隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)減弱程度更加明顯，第14天表達(dá)最弱，幾乎無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)。B組組間及與A組同時(shí)相點(diǎn)相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。C組術(shù)后第3天、第7天、第14天BMP-7的表達(dá)均顯著高于同時(shí)期B組的表達(dá)(P<0.05)。HGF在腎小管間質(zhì)的表達(dá)：在A組各時(shí)期均幾乎無(wú)表達(dá)。在B組、C組主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，腎間質(zhì)有少量表達(dá)，3天時(shí)

11、HGF表達(dá)較正常輕度增高，7天時(shí)表達(dá)至高峰，14天時(shí)表達(dá)減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組與B組同時(shí)相點(diǎn)相比HGF的表達(dá)均增高，組間、組內(nèi)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。TGF-β1在腎小管間質(zhì)的表達(dá)：在A組各時(shí)期僅腎小球、腎小管間質(zhì)微量表達(dá)，主要分布于腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，B組各時(shí)相點(diǎn)TGF-β1蛋白的表達(dá)隨時(shí)間呈進(jìn)行性升高，且隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)升高程度更加明顯，至第14天表達(dá)最強(qiáng)。組間、組內(nèi)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。進(jìn)一步

12、對(duì)各組BMP-7、HGF蛋白的表達(dá)與TGF-β1的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，BMP-7、HGF與TGF-β1的表達(dá)均顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了BMP-7、HGF及TGF-β1的表達(dá)部位及其表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。且1，25(OH)<,2>D<,3>能夠明顯減輕腎間質(zhì)纖維化，上調(diào)BMP-7、HGF蛋白的表達(dá)，進(jìn)而使TGF-β1的表達(dá)下降，從而發(fā)揮其在單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中對(duì)腎臟的保護(hù)作用，延緩和抑制