尿液水通道蛋白-2間接ELISA法的建立及幾種藥物對(duì)腎臟和尿液水通道蛋白-2的影響.pdf

1、目的：水通道蛋白-2(AQP2)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最具病理生理意義的水通道蛋白之一，對(duì)維持機(jī)體水平衡和調(diào)節(jié)體液容量至為重要。AQP2主要分布在腎臟集合管主細(xì)胞胞漿內(nèi)和管腔側(cè)細(xì)胞膜上，在機(jī)體內(nèi)主要受抗利尿激素(血管加壓素，AVP)經(jīng)血管加壓素2型受體(V2R)調(diào)節(jié)。其中部分腎臟AQP2蛋白可脫落于腎小管腔內(nèi)而被尿液沖出，尿液AQP2是反映AVP作用的內(nèi)在生物學(xué)指標(biāo)。我們?cè)谝郧肮ぷ鞯幕A(chǔ)上，試圖建立穩(wěn)定的定量檢測(cè)尿液AQP2的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

2、(ELISA)法，并觀察了正常大鼠不同水代謝狀態(tài)下尿液AQP2的變化規(guī)律。在許多伴有水代謝失衡的疾病中，如充血性心力衰竭、肝硬化、腎病綜合癥等，AQP2往往表達(dá)異常，因此尋找一些能干預(yù)AQP2表達(dá)的藥物就成了一個(gè)非常重要的課題?？ㄍ衅绽奥迳程棺鳛樽钄嗄I素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem，RAS)的藥物，在臨床上被廣泛應(yīng)用，尤其在充血性心力衰竭的治療中取得顯著的療效。本實(shí)驗(yàn)就正常生理情況下，卡托普利及洛沙

3、坦對(duì)大鼠腎臟和尿液中AQP2的改變進(jìn)行了研究。另外，中藥是我國(guó)一個(gè)寶貴資源，我們根據(jù)已有的中藥的相關(guān)信息，選取幾味中草藥，檢測(cè)藥物對(duì)腎臟及尿液AQP2的影響，試圖篩選出一至兩種能干預(yù)AQP2表達(dá)的中藥或者單體。 方法：人工合成AQP2蛋白C末端的CELHSPQSLPRGSKA多肽片段，并與牛血清白蛋白偶聯(lián)作為標(biāo)準(zhǔn)品，將AQP2多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)相連后免疫家兔，獲得兔抗鼠A

4、QP2多克隆抗體。所有大鼠均單獨(dú)飼養(yǎng)在代謝籠中，自由進(jìn)食，收集尿液。實(shí)驗(yàn)一，為建立間接ELISA法檢測(cè)尿液AQP2方法，我們研究了不同濃度SDS對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響、間接ELISA變異率、靈敏度以及大鼠正常、禁水24小時(shí)、以及水負(fù)荷狀態(tài)(80ml/kg)下的尿液AQP2排泄率的變化。實(shí)驗(yàn)二，對(duì)正常大鼠分別應(yīng)用卡托普利(10mg/d·kg)和洛沙坦(10mg/d·kg)，經(jīng)胃灌入，大鼠自由進(jìn)水，連續(xù)收集尿液，記錄尿量，用間接ELISA檢測(cè)尿液

5、AQP2的變化、對(duì)用藥后1天和7天的大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)分別用RT-PCR和免疫印跡法(Westernblotting)檢測(cè)V2R、AQP2mRNA和AQP2蛋白。實(shí)驗(yàn)三，從中藥中選取黃芪、澤瀉、豬苓三種藥物；劑量：1.2g·kg-1·d-1原生藥，連續(xù)灌胃7天，大鼠自由進(jìn)水，收集尿液，檢測(cè)尿液AQP2的變化，對(duì)改變尿液AQP2的藥物進(jìn)一步檢測(cè)腎內(nèi)髓質(zhì)V2R及AQP2mRNA和AQP2蛋白。 結(jié)果：一，SDS預(yù)處理尿液是ELISA成功檢

6、測(cè)尿液AQP2的重要因素，可提高檢測(cè)水平，用0.05％SDS-PBS倍比稀釋大鼠尿液最為合適。 二，本方法批內(nèi)差異系數(shù)6.5％，批間差異系數(shù)7％，靈敏度為112.5fmol/ml;禁水24后大鼠尿液AQP2/肌酐顯著增加(P＜0.01)，給予水負(fù)荷后尿液AQP2/肌酐顯著降低(P＜0.01)；且尿滲量與尿液AQP2/肌酐呈正相關(guān)(r=0.526，P＜0.001)。 三，卡托普利、洛沙坦對(duì)正常大鼠血鈉、尿量、尿滲量、尿AQ

7、P2的影響卡托普利組、洛沙坦組與對(duì)照組相比，血鈉無(wú)顯著差異。用藥后，卡托普利組與洛沙坦組尿量均增加(P＜0.05)；卡托普利組用藥前、用藥后1天、7天尿量分別是9.9±5.7ml、14±9.0ml、17.3±6.7ml；洛沙坦組用藥前、用藥后1天、7天尿量分別為8.4±6.0ml、7.5±4.4ml、17±4.5ml。洛沙坦組用藥前后尿滲量、尿AQP2濃度無(wú)顯著差異。用藥后，卡托普利組尿滲量降低(P＜0.05)，用藥前、用藥后1天、7天

8、分別為1678±257.8mosm/kgH2O、1446.7±215.6mosm/kgH2O、1434±214.9mosm/kgH2O。用藥后，卡托普利組尿AQP2濃度增加(P＜0.05)，用藥前、用藥后1天、7天分別為5.6±1.3ng/ml、9.2±1.7ng/ml、6.9±2.0ng/ml。 四，卡托普利、洛沙坦對(duì)正常大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)中AQP2及V2RmRNA和AQP2蛋白的影響 卡托普利組、洛沙坦組V2RmRNA在用

9、藥后1天、7天與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。洛沙坦組AQP2mRNA與AQP2蛋白在用藥后1天、7天與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。用藥后1天、7天與對(duì)照組相比，卡托普利組AQP2mRNA分別減少了0.28、0.31(P＜0.05)，AQP2蛋白分別減少了0.32、0.25(P＜0.05)?？ㄍ衅绽MAQP2mRNA和AQP2蛋白用藥后1天與7天相比無(wú)顯著差異。 五，應(yīng)用黃芪、澤瀉、豬苓對(duì)正常大鼠尿量及尿AQP2的影響用藥前后黃芪組尿量無(wú)顯著

10、差異，澤瀉組尿量有增加的趨勢(shì)，由用藥前的10.75±4.2ml增加到用藥后7天14.25±3.8ml；豬苓組尿量增多(P＜0.05)，由用藥前9.8±4.2ml增加到用藥后7天15.8±6.2ml. 用藥前后，黃芪及澤瀉組尿液中AQP2濃度無(wú)差異，而豬苓組尿液中AQP2濃度顯著降低(P＜0.01)，用藥前為9.47±2.2ng/ml，用藥后7天3.8±2.0ng/ml。相應(yīng)地，豬苓組尿液AQP2的排泄率，即尿液AQP2/肌酐(f

11、mol/umol)，由用藥前的560±180fmol/umol降為用藥后7天328±62fmol/umol(P=0.012)。 豬苓對(duì)正常大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)的AQP2與V2RmRNA表達(dá)及AQP2蛋白無(wú)明顯的影響。 結(jié)論：一，成功建立間接ELISA法檢測(cè)尿液AQP2。SDS預(yù)處理尿液是必要的。本方法批內(nèi)差異系數(shù)6.5％，批間差異系數(shù)7％，靈敏度為112.5fmol/ml。 二，卡托普利增加正常大鼠24h尿量，降低尿滲量