雞柔嫩艾美耳球蟲表面抗原SAG2和SAG7基因的克隆與表達(dá).pdf

1、雞球蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)的重要寄生蟲病，目前仍主要依賴各種抗球蟲藥物防治。近年來，由于球蟲抗藥性的產(chǎn)生和人們對(duì)綠色環(huán)保食品的呼喚，人們開始研究其它可持續(xù)的防治技術(shù)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)觀點(diǎn)出發(fā)，基因工程苗和/或核酸疫苗是最終控制雞球蟲病的必然選擇，而雞球蟲保護(hù)性抗原基因的篩選是研制基因工程苗及核酸疫苗研究的基礎(chǔ)。入侵相關(guān)蛋白是目前研究較多的球蟲抗原，主要包括子孢子/裂殖子表面蛋白、以及微線、棒狀體、折光體等分泌型亞細(xì)胞器抗原。Tomley等(20

2、04)分析了來自E.tenella的子孢子和第二代裂殖子的EST序列，得到了潛在的具有GPI錨定結(jié)構(gòu)域的表面抗原的mRNA序列，研究表明只有一種特定的EtSAGs在子孢子上表達(dá)，小部分在兩個(gè)階段都有表達(dá)，而大部分主要在第二代裂殖子上表達(dá)。本研究在國(guó)內(nèi)首先進(jìn)行了雞柔嫩艾美耳球蟲表面抗原SAG2、SAG7基因的克隆與原核表達(dá)，以為進(jìn)一步研究其免疫原性及其它生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。 (1)根據(jù)GenBank已報(bào)道(Tomley等，2005

3、)的E.tenella豪頓株表面抗原SAG2、SAG7mRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，用RT-PCR方法克隆了E.tenella楊陵株SAG2、SAG7基因，與豪頓株相比，核甘酸序列的同源性高達(dá)99％，推導(dǎo)的氨基酸序列相似性達(dá)99％，這說明SAG2、SAG7基因在不同地理株之間有很高的保守性，而他們與宿主細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系以及是否具有一定免疫原性，有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明。同時(shí)應(yīng)用3'-末端快速擴(kuò)增法(3'-RACE)獲得SAG2/SAG

4、7基因的3'-末端非翻譯區(qū)，測(cè)序表明具有真核生物mRNA基因3'-末端序列的特征，證明擴(kuò)增獲得SAG2/SAG7基因的3'-末端序列。 (2)擴(kuò)增了不含N端疏水性信號(hào)肽序列SAG2、SAG7基因，并將其克隆至表達(dá)載體pET-32a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)其在宿主菌BL21(DE3)中表達(dá)，誘導(dǎo)4h后表達(dá)量最高，重組蛋白占菌體總蛋白的50％。經(jīng)SDS-PAGE分析融合蛋白大小分別約為47ku、45ku