Eimeria tenella表面抗原基因sag10和λMZP5—7在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、雞柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)主要寄生在宿主盲腸的粘膜下，引起出血性腸炎，致病力強(qiáng)，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)健康發(fā)展。目前使用抗球蟲藥是防治肉仔雞病的主要手段，但抗藥性和藥物殘留等問題限制了球蟲藥物的廣泛應(yīng)用。研究表明重組球蟲抗原免疫雞后能產(chǎn)生一定的保護(hù)力，保護(hù)性抗原基因是其免疫功效的決定因素。球蟲表面抗原基因sag10、λMZP5-7是重要的候選基因之一。λMZP5-7的免疫保護(hù)作用已被證實(shí)，sag10基因在子孢子入侵和裂殖子

2、生殖階段均有表達(dá)，具有潛在的研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃诩状紶I(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母中表達(dá)Eimeriatenella表面抗原基因，為研制有效球蟲基因工程疫苗提供新的途徑。同時(shí)也為下一步進(jìn)行免疫保護(hù)研究提供材料。 本文提取Eimeriatenella北京株第二代裂殖子總RNA，根據(jù)Genbank報(bào)道序列，編號(hào)L08257、AJ586552設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到Eimeriatenella表面抗原基因λMZP5-7和sag10。

3、與pGEM-T載體連接后測(cè)序，結(jié)果λMZP5-7與報(bào)道序列完全一致共948bp，編碼315個(gè)氨基酸；pGEMT-sag10序列測(cè)定結(jié)果在NCBI上BLAST分析比較，結(jié)果表明，sag10基因編碼序列與文獻(xiàn)報(bào)道的序列同源性為99.01％，該球蟲表面抗原基因全長(zhǎng)708bp，編碼236個(gè)氨基酸。其中有7個(gè)核苷酸與報(bào)道序列差異，4個(gè)氨基酸序列有差異。分別將λMZP5-7、sag10與真核表達(dá)載體pPIC9K連接，構(gòu)建了pPIC9K-MZP和pP

4、IC9K-sag10分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，利用G418抗性篩選多拷貝重組菌株，搖瓶水平進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE和WesternBlot進(jìn)行檢測(cè)，分別在大約36KD和43kD處有明顯的免疫印跡條帶，結(jié)果MZP、SAG兩種抗原蛋白得到表達(dá)，而且能被特異性抗體所識(shí)別，具有生物學(xué)活性。篩選到表達(dá)量最高的菌株S7在5L發(fā)酵罐進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，隨著甲醇的誘導(dǎo)發(fā)酵上清中SAG10蛋白不斷累積，當(dāng)誘導(dǎo)120h后生物量達(dá)到最高