細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達(dá)通過增加脂肪酸氧化改善小鼠高脂血癥.pdf

1、研究背景和目的：
　　高脂血癥又稱為血脂代謝紊亂或異常，是由脂質(zhì)代謝紊亂引起的一種代謝性疾病，主要是指血漿或血清中的甘油三酯（TG）水平、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）升高和（或）高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）水平降低。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，并與心血管疾病如冠心病、心肌梗死及腎臟疾病、胰島素抵抗、脂肪肝的發(fā)病率與死亡率之間存在著明顯的正相關(guān)。流行病學(xué)研究表明

2、，隨著我們國家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，高脂血癥的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。如果不能進(jìn)行有效的干預(yù)，高脂血癥及其相關(guān)疾病將會(huì)成為影響人類身體健康及生活質(zhì)量的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。
　　花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）是生物體內(nèi)一種含量豐富、分布極為廣泛的多不飽和脂肪酸，是體內(nèi)多種重要生物活性物質(zhì)的前體。當(dāng)刺激作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2）的脂解作用下釋放出花生

3、四烯酸進(jìn)入胞漿，花生四烯酸通過環(huán)氧化酶（COX）、脂氧化酶（LOX）及細(xì)胞色素P450表氧化酶（Cytochrome P450，CYP450）等三種酶途徑進(jìn)行代謝。細(xì)胞色素P450表氧化酶主要包括2C和2J兩類，在人體內(nèi)許多組織中均有表達(dá)?；ㄉ南┧嵩贑YP450的作用下生成四種環(huán)氧-二十碳三烯酸（5,6-EET，8,9-EET，11,12-EET和14,15-EET）。體內(nèi)EETs在可溶性表氧化物水解酶（sEH）的作用下水解生成二羥基

4、-20碳三烯酸（DHET）。CYP450-EETs在維持機(jī)體心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。EETs具有擴(kuò)張血管，降低血壓的作用，其機(jī)制可能與激活 Ca2+敏感的 K+通道，引起血管平滑肌細(xì)胞超極化有關(guān)；EETs可以通過激活絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及新生血管形成；EET可以明顯減輕TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT信號(hào)通路，

5、增加抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)有關(guān)；EET可以顯著降低血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達(dá)，且 EET可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB），抑制單核細(xì)胞對(duì)血管壁的黏附來發(fā)揮抗炎作用。此外，EETs不僅能明顯促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲生長，還在改善胰島素抵抗、糖尿病腎病及肥胖等代謝性疾病中發(fā)揮著重要作用。
　　在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們假設(shè)CYP2J2基因過表達(dá)，使體內(nèi)EETs的水平增加，從而增加了肝臟組織及血管的脂肪酸氧化，改善了高脂飲

6、食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥。因此，我們探討了CYP2J2基因過表達(dá)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥的影響及其可能的分子機(jī)制，并在體外研究CYP2J2過表達(dá)或外源性加入EETs對(duì)肝細(xì)胞（HepG2、LO2）及內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）脂質(zhì)代謝異常模型的影響及其可能涉及的分子機(jī)制，從而明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝異常。
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn) CYP2J2基因過表達(dá)改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥的作用及其機(jī)制

7、　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接慍YP2J2基因過表達(dá)改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥的作用及其可能涉及的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.高脂血癥小鼠模型的建立：8周齡健康雄性內(nèi)皮特異性CYP2J2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因（Tie2-CYP2J2-Tr）小鼠和野生型 C57BL/6J小鼠各20只隨機(jī)分為四組：普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）：n=10，野生型C57BL/6J小鼠，給予普通飲食喂養(yǎng)；普通飲食+Ti

8、e2-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）：n=10，內(nèi)皮特異性 CYP2J2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因（Tie2-CYP2J2-Tr）小鼠，給予普通飲食喂養(yǎng)；高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）：n=10，野生型C57BL/6J小鼠，給予高脂飲食喂養(yǎng)；高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）：n=10，內(nèi)皮特異性 CYP2J2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因（Tie2-CYP

9、2J2-Tr）小鼠，給予高脂飲食喂養(yǎng)。按上述實(shí)驗(yàn)分組分別給予普通飲食和高脂飲食喂養(yǎng)16周后，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。
　　2.實(shí)驗(yàn)中稱取并記錄各組小鼠體重，留取小鼠血標(biāo)本離心后于-80℃保存；實(shí)驗(yàn)結(jié)束前留取各組小鼠24小時(shí)尿液標(biāo)本，加入二甲胺離心后放置于-80℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用戊巴比妥麻醉（50 mg/kg）并處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，留取血標(biāo)本，同時(shí)留取各組小鼠肝臟、血管、心臟、主動(dòng)脈、皮下及內(nèi)臟脂肪、腎臟等標(biāo)本在4％甲醛溶液中固定，于脫水機(jī)中

10、脫水浸臘后，使用石蠟包埋機(jī)包埋組織后存放于室溫備用（注：皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪于4%甲醛固定前稱重）。
　　3.檢測(cè)各組小鼠血清及肝臟中甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、β-羥基丁酸的水平及血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的水平；
　　4.采用H&E及油紅染色方法評(píng)估各組小鼠肝臟的形態(tài)學(xué)改變；
　　5.采用GC-FID/MS檢測(cè)血及肝臟中脂肪酸的水平；
　　6.采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠肝臟及

11、血管組織中PPARα及CPT-1的表達(dá)；
　　7.Western blot方法檢測(cè)各組小鼠肝臟及血管脂肪酸氧化相關(guān)蛋白p-AMPKα，p-ACC，CPT-1和PPARα的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.Western blot結(jié)果顯示，普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）肝臟及血管組織中均無CYP2J2蛋白表達(dá)，普通飲食+Tie2

12、-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）及高脂飲食+ Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）肝臟及血管組織中CYP2J2表達(dá)豐富（P<0.05），表明CYP2J2在Tie2-CYP2J2-Tr小鼠體內(nèi)成功過表達(dá)。ELISA檢測(cè)尿液14,15-DHET結(jié)果顯示，普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）及高脂飲食+Tie2

13、-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）小鼠尿液中14,15-DHET的含量，均明顯高于普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）尿液中14,15-DHET的含量（P<0.05），提示CYP2J2基因可成功代謝花生四烯酸為EETs并發(fā)揮2.在普通飲食喂養(yǎng)下，野生型C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠體

14、重、內(nèi)臟及皮下脂肪含量并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組的體重、皮下及內(nèi)臟脂肪含量明顯高于普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（P<0.05），高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）小鼠體重、皮下及內(nèi)臟脂肪含量較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組明顯降低（P<0.05）。
　　3.高脂飲食可以顯著增加野生型C57BL/6J小鼠血及肝臟組織中甘油

15、三酯及膽固醇的含量（P<0.05）；高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）血及肝臟中甘油三酯的含量、肝臟中膽固醇的含量均明顯低于高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）（P<0.05）。雖然高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）血中膽固醇的含量有下降趨勢(shì)，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。這一結(jié)果表明CYP2J2基因過表達(dá)可以明顯抑制高脂飲

16、食誘導(dǎo)的血及肝臟中甘油三酯的增高。高脂飲食顯著降低野生型C57BL/6J小鼠血及肝臟組織中β-羥基丁酸的含量（P<0.05），而高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）血漿及肝臟中β-羥基丁酸的含量明顯高于高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）（P<0.05）。然而，普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（

17、Normal Chow+Tie2-CYP2J2）血及肝臟中甘油三酯、膽固醇及β-羥基丁酸的含量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明 CYP2J2基因過表達(dá)顯著改善高脂血癥小鼠的脂質(zhì)代謝異常。
　　4.高脂飲食可以顯著增加野生型 C57BL/6J小鼠血漿中 ALT及 AST的含量（P<0.05），高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組ALT及AST的含量明顯低于高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠（P<0.05）；不

18、僅如此，肝臟H&E結(jié)果顯示給予野生型C57BL/6小鼠高脂飲食喂養(yǎng)16周后，小鼠肝臟組織中脂質(zhì)積聚情況較普通飲食喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠明顯增多（P<0.05）；給予 Tie2-CYP2J2-Tr小鼠高脂喂養(yǎng)，其肝臟的脂質(zhì)積聚情況較高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠明顯減輕，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；然而，普通飲食喂養(yǎng)條件下，C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠的肝臟組織HE染色并無明顯差異（P>0.05）。上述結(jié)果在

19、各組小鼠肝臟組織的油紅染色中更進(jìn)一步得到證實(shí)。這些結(jié)果表明CYP2J2過表達(dá)可以明顯降低肝臟組織中高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚，從而改善了高脂血癥小鼠的肝臟功能。
　　5. GC-FID/MS結(jié)果反應(yīng)了CYP2J2基因過表達(dá)后對(duì)小鼠血和肝臟組織脂肪酸含量的影響：高脂飲食可以顯著增加野生型 C57BL/6J小鼠血漿及肝臟組織中脂肪酸的含量（P<0.05），CYP2J2過表達(dá)可以顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪酸的升高（P<0.05），但其對(duì)

20、血漿中脂肪酸的含量并無明顯影響，即高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組與高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組血中脂肪酸的含量并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。同樣，在普通飲食喂養(yǎng)下，野生型C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠的血漿及肝臟中脂肪酸的含量并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　6.實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果顯示普通飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和普通飲食+

21、Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）肝臟及血管組織CPT-1及PPARα的表達(dá)水平無明顯差異（P>0.05）；高脂飲食可以顯著降低野生型C57BL/6J小鼠肝臟及血管組織中CPT-1及PPARα的表達(dá)（P<0.05），高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）肝臟及血管組織CPT-1及PPARα的水平較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT

22、）明顯升高（P<0.05）。
　　7.Western blot結(jié)果顯示：普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）小鼠肝臟及血管組織中p-AMPKα，p-ACC，CPT-1及PPARα的表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）小鼠肝臟及血管組織 p-A

23、MPKα，p-ACC，CPT-1及 PPARα的表達(dá)較普通飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）明顯降低（P<0.05），高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）肝臟組織及血管中上述指標(biāo)較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）明顯增高（P<0.05），表明 CYP2J2基因過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織和血管脂肪酸氧化相關(guān)蛋白 p-AMPKα，

24、p-ACC，CPT-1及 PPARα的降低。
　　二、體外實(shí)驗(yàn) CYP2J2過表達(dá)及外源性EETs改善游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)的HepG2、LO2及HUVECs脂質(zhì)代謝異常的作用及其機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接?CYP2J2過表達(dá)及外源性 EETs改善游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)的HepG2、LO2及HUVECs脂質(zhì)代謝異常的作用及其可能的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1. HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs培養(yǎng)于含

25、10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待肝細(xì)胞（HepG2、LO2）及內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）生長到80%-90%匯合時(shí)消化并傳代，當(dāng)細(xì)胞生長至70%-80%匯合并經(jīng)同步化處理后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的CYP2J2及GFP基因（rAAV-CYP2J2及rAAV-GFP）轉(zhuǎn)染HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs，于熒光顯微鏡下觀察確定轉(zhuǎn)染成功后加入AMPKα抑制劑

26、（Compound C）、PPARα抑制劑（GW6471）及游離脂肪酸（FFA）處理24小時(shí)；
　　3.經(jīng)同步化處理的HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs，給予AMPKα抑制劑（Compound C）、PPARα抑制劑（GW6471）、14,15-EET抑制劑（14,15-EEZE）及14,15-EET，F(xiàn)FA共同孵育24小時(shí)；
　　4.檢測(cè)干預(yù)的HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs內(nèi)甘油三酯的水平；
　　5.West

27、ern blot方法檢測(cè)干預(yù)的細(xì)胞p-AMPKα，p-ACC，CPT-1及PPARα的蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. FFA誘導(dǎo)的HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs中甘油三酯的水平明顯高于無處理的細(xì)胞（P<0.05）。FFA組與FFA+rAAV-GFP組相比甘油三酯水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），F(xiàn)FA+ rAAV-CYP2J2組各細(xì)胞甘油三酯水平較FFA組明顯降低，Compound C及GW6471均能逆轉(zhuǎn)r

28、AAV-CYP2J2的降甘油三酯作用（P<0.05）。同樣，F(xiàn)FA+14,15-EET組各細(xì)胞甘油三酯水平較FFA組顯著降低，14,15-EEZE及GW6471均能逆轉(zhuǎn)14,15-EET的降甘油三酯作用（P<0.05）。
　　2.Western blot檢測(cè)了HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs中脂肪酸氧化相關(guān)蛋白p-AMPKα，p-ACC及 CPT-1的表達(dá)。結(jié)果顯示與未干預(yù)細(xì)胞相比，F(xiàn)FA能顯著降低HepG2、LO2細(xì)胞及HU

29、VECs中p-AMPKα，p-ACC及CPT-1的蛋白表達(dá)（P<0.05），轉(zhuǎn)染rAAV-CYP2J2干預(yù)FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞，較單純FFA干預(yù)可以明顯增加p-AMPKα，p-ACC，CPT-1的蛋白表達(dá)，而這一效應(yīng)可以在一定程度上被Compound C阻斷（P<0.05），表明CYP2J2的降甘油三酯作用在一定程度上依賴于AMPKα/ACC/CPT-1信號(hào)通路。與上述結(jié)果相似，與單純FFA干預(yù)相比，14,15-EET可以明顯增加FFA干預(yù)

30、的細(xì)胞p-AMPKα，p-ACC及CPT-1的蛋白表達(dá)，14,15-EEZE在一定程度上阻斷了上述效應(yīng)（P<0.05）。上述結(jié)果提示CYP2J2過表達(dá)或外源性給予14,15-EET可能通過增加脂肪酸β氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)從而降低細(xì)胞甘油三酯的積聚。
　　3.Western blot結(jié)果顯示CYP2J2過表達(dá)能明顯逆轉(zhuǎn)FFA誘導(dǎo)的PPARα表達(dá)降低，而該效應(yīng)在一定程度上被Compound C阻斷（P<0.05），表明PPARα在一定程

31、度上受AMPKα的調(diào)控。與未處理細(xì)胞相比，F(xiàn)FA誘導(dǎo)可降低細(xì)胞PPARα及CPT-1的表達(dá)，CYP2J2過表達(dá)或給予外源性14,15-EET可以明顯逆轉(zhuǎn)FFA誘導(dǎo)的PPARα及CPT-1表達(dá)的降低，該效應(yīng)在一定程度上被 GW6471阻斷（P<0.05），該結(jié)果提示除AMPKα/ACC/CPT-1信號(hào)途徑外，CYP2J2過表達(dá)或給予14,15-EET尚可通過PPARα/CPT-1增加脂肪酸β氧化，從而達(dá)到降低細(xì)胞內(nèi)TG含量的作用。

32、　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1. CYP2J2過表達(dá)可以明顯減輕高脂血癥小鼠體重、皮下及內(nèi)臟脂肪含量，顯著改善高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠高脂血癥，減輕高脂血癥引起的肝臟脂肪酸及脂質(zhì)積聚，提示CYP2J2過表達(dá)具有改善高脂血癥小鼠脂代謝異常的作用。
　　2.CYP2J2過表

33、達(dá)可以顯著增加肝臟組織及血管脂肪酸β氧化相關(guān)蛋白p-AMPKα，p-ACC，CPT-1及PPARα的表達(dá)。
　　3.CYP2J2過表達(dá)或外源性 EETs均可通過激活 AMPKα/ACC/CPT-1及PPARα/CPT-1信號(hào)通路，從而增加脂肪酸β氧化，最終改善細(xì)胞甘油三酯積聚；其中，PPARα在一定程度上受AMPKα的調(diào)控。
　　4.CYP表氧化酶-EETs系統(tǒng)通過增加脂肪酸β氧化，從而降低血漿及肝臟中甘油三酯含量，減輕肝臟