利用豬腎臟脫細(xì)胞支架進(jìn)行腎臟再生的研究.pdf

1、研究目的：
　　目前終末期腎臟病治療主要有兩種方法:血液透析和腎臟移植。雖然血液透析可以延長(zhǎng)終末期腎病患者生命，但血液透析排泄功能差，目前效率僅為10％，且無(wú)內(nèi)分泌功能，患者生活質(zhì)量、生存時(shí)間均不理想。腎臟移植為目前最佳治療方法，但是供體腎源短缺，嚴(yán)重阻礙了腎臟移植的廣泛應(yīng)用，造成了許多患者在等待器官中死亡，而且移植后的排斥反應(yīng)、免疫抑制藥物的使用帶來(lái)的副作用也影響了移植物及受者長(zhǎng)期存活。
　　再生醫(yī)學(xué)為解決這一問題帶來(lái)了希

2、望。廣義上腎臟再生主要有四種方式:(1)單純基于細(xì)胞進(jìn)行再生;(2)胚胎后腎移植;(3)人工生物合成材料;(4)生物支架全器官再生?；诩?xì)胞進(jìn)行的腎臟再生，目前研究側(cè)重于干細(xì)胞在腎臟損傷中的修復(fù)機(jī)制。干細(xì)胞修復(fù)腎臟功能，一般都是通過(guò)血液系統(tǒng)進(jìn)入機(jī)體，并沒有特異性，并且目前沒有試驗(yàn)證實(shí)其發(fā)生機(jī)制。而通過(guò)細(xì)胞3D培養(yǎng)，如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等，在體外能夠形成腎小球及腎小管樣的結(jié)構(gòu)，但是不能形成完整的腎臟。后腎為成體腎臟的前體，利用胚胎

3、后腎移植到受體大網(wǎng)膜上，后腎可以有新生血管長(zhǎng)入受體，并且能夠生長(zhǎng)至正常腎臟大小。利用異種的動(dòng)物的后腎進(jìn)行人體的移植，通過(guò)囊胚互補(bǔ)的方式能夠解決免疫排斥的問題，但是新生的腎臟血管結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)法進(jìn)行移植，處于腹膜上影響形體以及功能。理論上后腎確實(shí)是一個(gè)良好的腎臟再生的來(lái)源，但是其應(yīng)用仍然存在較多的問題，比如倫理問題，并且長(zhǎng)期存活情況并未有報(bào)道。腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，細(xì)胞種類繁多，擁有泌尿及內(nèi)分泌功能，人工生物合成材料作為支架，難以應(yīng)用于腎臟。

4、>　　近年來(lái)，利用器官脫細(xì)胞支架進(jìn)行全器官再生已然成為研究熱點(diǎn)。脫細(xì)胞支架由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)構(gòu)成，是一種具有3D結(jié)構(gòu)和功能的支架網(wǎng)絡(luò)。ECM可以為細(xì)胞提供3D支架，分泌和儲(chǔ)存生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。自身ECM因其生物兼容性好、具備細(xì)胞生存的必須物質(zhì)（蛋白質(zhì)和多糖類）、基質(zhì)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子、完整的血管系統(tǒng)、能夠誘導(dǎo)祖細(xì)胞向器官特異性細(xì)胞分化，因此為器官再生提供了一個(gè)良好的支架。近年來(lái)尖端科技的發(fā)展使研究者開始探索保留自身器

5、官的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行腎臟再生?？傊摷?xì)胞支架為再生提供了一個(gè)良好的平臺(tái)，其保留了細(xì)胞生存所不可缺少的微環(huán)境。運(yùn)用脫細(xì)胞支架進(jìn)行器官再生研究已經(jīng)在心臟、肺臟、肝臟、動(dòng)脈瓣、肌腱等再生方面有過(guò)成功報(bào)道。但是去細(xì)胞試劑是否破壞了ECM的部分關(guān)鍵結(jié)構(gòu)尚不清楚，并且完全的去細(xì)胞化對(duì)于器官再生具有非常重要的意義，因?yàn)榧?xì)胞成分殘留可能導(dǎo)致新注入的細(xì)胞凋亡以及引起炎癥反應(yīng)。因此建立一個(gè)良好的器官去細(xì)胞化流程至關(guān)重要。已有研究顯示應(yīng)用大鼠腎臟細(xì)胞對(duì)大鼠腎

6、臟脫細(xì)胞支架進(jìn)行再細(xì)胞化，獲得了有功能可移植的腎臟。但是其腎臟體積較小，距離臨床應(yīng)用仍有很大距離。豬腎臟大小、解剖學(xué)與人類相近，并具有分支型、迷走型腎動(dòng)脈出現(xiàn)率低的優(yōu)點(diǎn)，從解剖學(xué)角度看豬腎臟比較符合異種移植的要求。
　　針對(duì)上述問題，我們擬用豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制作豬腎臟脫細(xì)胞支架，通過(guò)相關(guān)鑒定，應(yīng)用胚胎干細(xì)胞對(duì)豬腎臟脫細(xì)胞支架進(jìn)行再細(xì)胞化，為獲得有功能可移植的大動(dòng)物腎臟，為將來(lái)對(duì)人體腎臟進(jìn)行腎臟組織工程研究提供科研依據(jù)。
　　研

7、究方法：
　　1.制作豬腎臟脫細(xì)胞支架。以家豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將豬麻醉后取出腎臟。應(yīng)用自制腎臟灌流設(shè)備連接灌注液與豬腎動(dòng)脈，立刻使用磷酸鈉緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗，以沖出腎臟內(nèi)血液，防止血凝發(fā)生。然后以8ml/min速度向豬腎灌注0.5％十二烷基磺酸鈉(SDS)以及1％的Triton-x100，對(duì)豬腎臟進(jìn)行去細(xì)胞化，待腎臟變?yōu)榘咨晕⑼该鲿r(shí)，停止灌注，再用PBS沖洗4天，將SDS沖洗干凈，獲得豬腎臟脫細(xì)胞支架。
　　2.豬腎臟脫

8、細(xì)胞支架的鑒定。應(yīng)用免疫組化、免疫熒光、Elisa檢測(cè)、DNA定量分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及膠原含量測(cè)定等方法做相關(guān)鑒定。Masson染色用于鑒定脫細(xì)胞前后細(xì)胞成分去除是否徹底以及膠原保留情況;免疫熒光用于鑒定Ⅳ型膠原和層黏連蛋白;血管造影鑒定血管系統(tǒng)保留完整情況;DNA及膠原檢測(cè)脫細(xì)胞前后DNA及膠原含量;Elisa檢測(cè)脫細(xì)胞前后部分細(xì)胞因子的變化;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法測(cè)定PERV病毒;分子生物學(xué)方法測(cè)定有無(wú)脫細(xì)胞液體殘留，最終確定標(biāo)準(zhǔn)的

9、制定豬腎臟脫細(xì)胞支架的方法。
　　3.胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。我們經(jīng)過(guò)小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)用免疫熒光方法對(duì)OCT4、SOX2以及NANOG三種干細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，確定其干細(xì)胞特性。應(yīng)用于細(xì)胞大量擴(kuò)增技術(shù)對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，以準(zhǔn)備用于對(duì)脫細(xì)胞支架進(jìn)行細(xì)胞種植。
　　4.細(xì)胞種植。將胚胎干細(xì)胞大量擴(kuò)增后制備細(xì)胞懸液，濃度約5×107/ml，共計(jì)10ml。利用28G套管針將其多點(diǎn)穿刺注入腎臟內(nèi)部。每24h注射一次，共計(jì)三次

10、，最后一次注射后靜置24h，在每次注射后，腎臟放置于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，溫度37℃，氣體為5％CO2和95％空氣混合氣體。
　　5.體外器官培養(yǎng)。腎臟注射細(xì)胞完畢后，應(yīng)用相關(guān)培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)基中先通過(guò)5％CO2和95％空氣混合氣體，氣體經(jīng)過(guò)清潔過(guò)濾。整個(gè)灌注培養(yǎng)系統(tǒng)置于37℃的清潔環(huán)境中，連續(xù)培養(yǎng)十天，然后取組織固定后經(jīng)過(guò)HE染色以及免疫熒光進(jìn)行鑒定。
　　研究結(jié)果：
　　1.在大體形態(tài)方面，豬腎臟經(jīng)過(guò)30h的

11、5％SDS及1％Triton-X100的連續(xù)灌注沖洗，逐漸變?yōu)樯酝该鞯陌咨I臟，獲得豬腎臟脫細(xì)胞支架。
　　2.通過(guò)Masson鑒定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞成分已經(jīng)完全去掉，僅剩藍(lán)色的膠原成分;DNA定量分析表明僅剩余少量DNA成分，低于正常含量的5％，膠原含量以及部分細(xì)胞因子含量脫細(xì)胞前后無(wú)差異;免疫熒光檢測(cè)顯示Ⅳ型膠原及層粘連蛋白在脫細(xì)胞后保留完整。通過(guò)血管造影檢查發(fā)現(xiàn)，造影劑從腎動(dòng)脈進(jìn)入后逐級(jí)向各級(jí)血管分支，最后從血管末梢滲出，整個(gè)過(guò)程中在

12、血管干道沒有造影劑漏出，證明所做支架血管完整性良好。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)豬腎臟內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)為陰性，不存在感染種植細(xì)胞的可能。
　　3.胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)較好，在連續(xù)傳代培養(yǎng)后，依然保持良好的克隆狀態(tài)，邊緣較為光滑。通過(guò)免疫熒光測(cè)定，干細(xì)胞相關(guān)marker: OCT4、SOX2及NANOG表達(dá)較好，證明經(jīng)過(guò)我們的大量擴(kuò)增之后，胚胎干細(xì)胞依然保持良好的干細(xì)胞特性。
　　4.細(xì)胞種植過(guò)程順利，細(xì)胞貼附良好。通過(guò)自制大

13、動(dòng)物器官培養(yǎng)裝置連續(xù)培養(yǎng)后，通過(guò)HE染色及DAPI免疫熒光測(cè)定顯示有細(xì)胞在腎臟支架內(nèi)生長(zhǎng)，證明經(jīng)過(guò)連續(xù)的器官灌注培養(yǎng)，能夠較好的保持脫細(xì)胞支架內(nèi)貼附細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。
　　研究結(jié)論：
　　1.我們建立了一套快速、有效的大動(dòng)物脫細(xì)胞設(shè)備及支架制備流程，通過(guò)0.5％的SDS及1％Triton結(jié)合灌注，能夠制備結(jié)構(gòu)與功能良好的豬腎臟脫細(xì)胞支架。
　　2.所制備豬腎臟脫細(xì)胞支架能夠完整保留正常腎臟的3D結(jié)構(gòu)、血管系統(tǒng)以及集合系統(tǒng)