灌注法制備大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞相容性研究.pdf

1、研究背景：
　　 腎臟是人體重要的生命器官,腎臟疾病嚴(yán)重影響著患者的健康和生活質(zhì)量,針對(duì)這種疾病的治療一直受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。血液透析和腎臟移植是目前臨床上常用的治療終晚期腎病與急性腎衰的方法,透析只能替代。腎臟的部分功能,腎臟移植則受到移植器官來源有限及移植后引發(fā)免疫排斥反應(yīng)等因素的限制。因此,針對(duì)終晚期腎病和腎衰的治療迫切需要尋找新的技術(shù)和手段。隨著組織工程研究的不斷深入,運(yùn)用組織工程技術(shù)研制可供移植的腎臟組織為腎

2、病的治療帶來了新的希望。
　　 組織工程學(xué)是一門近年來新興的綜合性學(xué)科,是一門運(yùn)用細(xì)胞、工程材料學(xué)方法和創(chuàng)造適當(dāng)生化、理化因素,以改善或替代組織的生物學(xué)功能的學(xué)科,是人類治療組織、器官的功能衰竭和缺失的研究方向。其基本原理和方法是令少量組織細(xì)胞通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增達(dá)到一定數(shù)量后,接種到具有一定空間結(jié)構(gòu)的支架上,構(gòu)成有生命活力的細(xì)胞支架復(fù)合物,并移植到體內(nèi),以達(dá)到修復(fù)或替代組織損傷的目的。近年來,組織工程學(xué)有了迅猛的發(fā)展,對(duì)多種組織均

3、有相應(yīng)的組織工程器官面世的報(bào)道,如骨、軟骨、血管、膀胱等,尤其在泌尿系統(tǒng)組織工程學(xué)上,國(guó)外學(xué)者更已將組織工程膀胱投入臨床試驗(yàn),成為首個(gè)植入人體內(nèi)的真正意義上的組織工程人造器官。它既為眾多研究者們建立了典范,同時(shí)也開啟了更為廣闊的未知領(lǐng)域:是否所有的人體組織均能通過組織工程學(xué)的方法創(chuàng)造出人造器官?截至本研究完成前,國(guó)內(nèi)外尚未有組織工程。腎體外構(gòu)建成功的案例,并且學(xué)者們的研究重點(diǎn)均在于如何體外培育腎細(xì)胞,而合適的細(xì)胞支架則一直鮮有提及。我科

4、實(shí)驗(yàn)性應(yīng)用灌注法制備大鼠全腎脫細(xì)胞基質(zhì)支架,目前未見其它相關(guān)報(bào)道,制備的脫細(xì)胞基質(zhì)是否具有良好的細(xì)胞相容性尚不確切。
　　 研究目的：
　　 1.探討灌注法制備大鼠的全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)(ACM)支架的條件和方法。
　　 通過對(duì)多種細(xì)胞支架的比較發(fā)現(xiàn),脫細(xì)胞基質(zhì)(Acellular Matrix)是一種良好的細(xì)胞支架。它具有原組織的宏觀及微觀結(jié)構(gòu),并且富含膠原、彈力纖維,并含微纖維蛋白、纖維結(jié)合素、層粘連蛋白、蛋白多

5、糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等。經(jīng)脫細(xì)胞后留下的細(xì)胞外基質(zhì)成分具有良好的生物相容性,并且各種組成的成分分別攜帶或接收不同的信號(hào),誘導(dǎo)不同的細(xì)胞,因而對(duì)于細(xì)胞類型中基因表達(dá)方式,細(xì)胞的粘附、移行、轉(zhuǎn)移等都有極重要的影響。目前制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法基本局限于以酶或去污劑浸泡洗脫,而對(duì)實(shí)質(zhì)性臟器基本無法達(dá)到脫細(xì)胞的目的。本研究以去污劑為洗脫細(xì)胞的溶劑,引入灌注法,通過血管、腎小球、腎小管這一自然平臺(tái)達(dá)到將腎臟內(nèi)部細(xì)胞洗脫的目的,并在研究過程中探討、

6、建立一套系統(tǒng)的制備方法。
　　 2.觀察并證明所制備的全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)具有規(guī)則的三維空間結(jié)構(gòu),良好的孔隙率,且已將細(xì)胞完全洗脫。
　　 由于已將在移植中產(chǎn)生抗原性的最重要成分--細(xì)胞洗脫,余下的脫細(xì)胞基質(zhì)不存在MHC抗原。后者所誘發(fā)的免疫反應(yīng)為類Th-2反應(yīng),與異種移植誘發(fā)的典型Th-1反應(yīng)不同。而這種反應(yīng)對(duì)植入的脫細(xì)胞基質(zhì)并無排斥作用,表明了脫細(xì)胞基質(zhì)具有種屬差異性小、生物相容性佳等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)本研究建立的方法所制備的脫細(xì)

7、胞基質(zhì),在肉眼觀察下呈均-白色半透明,我們通過掃描電鏡觀察檢測(cè),從而說明其具有良好的微觀孔隙結(jié)構(gòu)以利于細(xì)胞生長(zhǎng),且已將細(xì)胞完全洗脫。
　　 3.檢測(cè)鼠腎脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞相容性；
　　 應(yīng)用L929細(xì)胞檢測(cè)鼠腎脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞相容性；探討灌注法制備的腎脫細(xì)胞基質(zhì)作為細(xì)胞支架,構(gòu)建泌尿系實(shí)質(zhì)性組織工程器官的可行性。
　　 研究方法
　　 1.大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備。
　　 取12周齡的whista

8、r大鼠共20只,10％水合氯醛腹腔注射麻醉下完整切除兩側(cè)腎臟,分別保留輸尿管、腎靜脈及腎動(dòng)脈。每對(duì)腎臟隨機(jī)取1只作對(duì)照組,另1只作實(shí)驗(yàn)組。所有腎臟均沿腎動(dòng)脈插入留置針建立灌注通道。實(shí)驗(yàn)組以肝素化PBS溶液輕推測(cè)試通道密閉性完整后,依次灌注肝素化PBS溶液,1％十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液,去離子水,1％TritonX-100溶液以及含青鏈霉素的PBS溶液。調(diào)整灌注壓強(qiáng)及灌注時(shí)間,經(jīng)修正獲得最佳方案。
　　 2.采用掃描電鏡觀察支

9、架微觀結(jié)構(gòu)；
　　 經(jīng)2.5％戊二醛灌注固定,梯度法丙酮脫水、乙酸異戊酯置換、臨界點(diǎn)法干燥、真空噴鍍后掃描電鏡下觀察標(biāo)本。
　　 3.檢測(cè)鼠腎脫細(xì)胞基質(zhì)與L929細(xì)胞(鼠成纖維細(xì)胞)的細(xì)胞相容性；
　　 (1)培養(yǎng)L929細(xì)胞作為種子細(xì)胞,設(shè)立空白組(無細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(培養(yǎng)基)和實(shí)驗(yàn)組(鼠腎脫細(xì)胞基質(zhì)浸提液)及陽性對(duì)照組(含O.64％苯酚溶液的培養(yǎng)基)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞,4x103/孔接種于96孔板

10、中,每組各5孔,于接種24,72,120 h,通過MTT法顯色,于酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值,計(jì)算相對(duì)增殖率。
　　 統(tǒng)計(jì)方法:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示((x)±s),應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)第24、72和120小時(shí)三個(gè)時(shí)間各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的方差分析(a=0.05)。
　　 (2)設(shè)立對(duì)照組(培養(yǎng)基)、實(shí)驗(yàn)組(鼠腎脫細(xì)胞基質(zhì)浸提液)及陽性對(duì)照組(含0.64％苯酚溶液的培養(yǎng)基),培養(yǎng)48 h后應(yīng)

11、用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 統(tǒng)計(jì)方法:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示((x)±s),采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析(a=0.05)
　　 研究結(jié)果
　　 1.大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及灌注過程。
　　 共對(duì)20只大鼠完成實(shí)驗(yàn)。開始灌注液流速慢,約10～40滴/min,隨后逐漸加快。更換1％SDS后腎顏色從外至內(nèi)分段逐漸變白色半透明,120～150min顏色

12、變化逐漸明顯,基本可在肉眼下看清腎內(nèi)分支狀管脈結(jié)構(gòu),直至約180～240min腎完全呈均-白色半透明狀,灌注液滴速保持在100～120滴/min,此時(shí)測(cè)量灌注液總使用量約400～600ml。
　　 2.大鼠全腎臟脫細(xì)胞基質(zhì)的微觀檢測(cè)結(jié)果。
　　 掃描電鏡觀察結(jié)果:對(duì)照組可見腎小球及近曲小管等結(jié)構(gòu)完整；實(shí)驗(yàn)組可見腎小體、腎小管周圍的基膜及膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其余窄間均為形狀規(guī)則的孔隙,內(nèi)無細(xì)胞。
　　

13、 3.大鼠全腎臟脫細(xì)胞支架細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 (1)第24、72和120小時(shí)實(shí)驗(yàn)組吸光度值分別為0.620±0.032、0.957±0.007和1.336±0.011,陰性對(duì)照吸光度值分別為0.602±0.017、0.965±0.005和1.347±0.006,與陰性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.902>0.05)。L929細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組第24,72,120小時(shí)相對(duì)增殖率分別為102.99％,99.17％,99.18％,

14、脫細(xì)胞基質(zhì)支架在各個(gè)時(shí)間段(24,72,120小時(shí))的細(xì)胞毒性評(píng)分為(0-1級(jí)),符合生物材料的醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn),說明灌注法制備的大鼠腎脫細(xì)胞基質(zhì)無明顯細(xì)胞毒性,對(duì)細(xì)胞增殖無影響。而陽性對(duì)照組的細(xì)胞毒性評(píng)分為3級(jí)或4級(jí)。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可看出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩條生長(zhǎng)曲線幾乎平行,說明實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響無顯著差別。
　　 (2)應(yīng)用L929細(xì)胞與大鼠腎脫細(xì)胞基質(zhì)浸提液共培養(yǎng)48h,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),與陰性對(duì)照