黑大蒜提取物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響.pdf

1、前言
　　 大蒜是一種含有多種有機(jī)硫化合物的植物,其中最重要的有效成分之一是大蒜素。人們用大蒜來治療感染,槍傷,蛇咬,腹瀉,風(fēng)濕,心臟病,糖尿病以及其它的一些生理功能紊亂,人們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)其具有降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等功效。大蒜來源的有機(jī)硫化合物對(duì)一些人類腫瘤,如前列腺癌,胸腺癌,結(jié)腸癌,肺癌,膀胱癌等有很好的抑制作用。大蒜的化學(xué)組成十分復(fù)雜,其中有生物活性的成分超過100種。其中最重要和最獨(dú)特

2、的是有機(jī)硫化合物的含量非常高,是其他含有高硫的蔬菜如洋蔥、椰菜的4倍多。近年來日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)在控制濕度和溫度的情況下,普通的白大蒜可以經(jīng)過處理轉(zhuǎn)化為黑大蒜。黑大蒜去除了大蒜的異味,帶有甜味,口感好,無需再經(jīng)處理即可直接食用。已有研究報(bào)道黑大蒜較白大蒜含有更多的氨基酸、有機(jī)硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸,因此與白大蒜相比,更具有應(yīng)用前景。然而目前有關(guān)黑大蒜對(duì)機(jī)體免疫功能影響國內(nèi)外尚未見報(bào)道。為此,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用自制的黑大蒜提取物溶液,腹腔注射給小

3、鼠,觀察了黑大蒜提取物作為免疫調(diào)節(jié)劑的作用,為黑大蒜的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)一步提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料
　　 一、主要試劑
　　 黑大蒜提取物(干粉,由日本弘前大學(xué)佐佐木甚一教授惠贈(zèng)),RPMI 1640培養(yǎng)基,小牛血清,0.01 M PBS緩沖液,紅細(xì)胞裂解液,LDH底物液,Griess試劑,IL-2、FN-γ、IL-4、TNF-α ELISA試劑盒。
　　 二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 BALB/c小

4、鼠,6-8周齡,SPF級(jí),購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理
　　 40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為8組,其中第1-7組為實(shí)驗(yàn)組,第8組為對(duì)照組。將黑大蒜提取物用生理鹽水配制成1mg/ml的溶液。實(shí)驗(yàn)組每天腹腔注射100μl的黑大蒜提取物溶液,對(duì)照組每天腹腔注射100μl的生理鹽水。連續(xù)注射5天。于末次注射后的1-7天,從第1組開始,每天處死一組小鼠,第8組小鼠于第7天處死。

5、
　　 二、樣品的采集與檢測(cè)
　　 1、脾細(xì)胞分離及其懸液的制備
　　 頸椎脫位處死小鼠,常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107 /ml。
　　 2、ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ以及Th2細(xì)胞因子IL-4的水平
　　 3、LDH釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷活性
　　 4、Griess法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO水平
　　 5、RT-

6、PCR半定量技術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞FasL mRNA的表達(dá)水平
　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,P<0.05有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 1、NK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)結(jié)果
　　 在連續(xù)5天給予BALB/c小鼠注射黑大蒜提取物后,比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性,結(jié)果表明:與對(duì)照組(5.82±1.38％)相比,黑大蒜提取物處理4-6天后,實(shí)

7、驗(yàn)組小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性顯著性升高,并在第5天達(dá)到峰值(11.21±1.17％),隨后下降。
　　 2、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平的檢測(cè)結(jié)果
　　 本實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)了Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α和Th2細(xì)胞因子IL-4的分泌水平。我們發(fā)現(xiàn)在給予小鼠連續(xù)注射5天黑大蒜提取物后,IL-2的分泌水平在處理后第6天有明顯升高,與對(duì)照組(20.14±3.88 pg/ml)相比,有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

8、5)。TNF-α的水平從處理后第1天就開始明顯升高(P<0.01),在第3天達(dá)到峰值(68.73±0.64 pg/ml),隨后下降,但一直到第7天,均高于對(duì)照組(27.36±8.30 pg/ml)。IFN-γ的分泌水平在處理結(jié)束后也有顯著升高,其中在第3天達(dá)到峰值(105.05±55.73 pg/ml),隨后下降,到第7天接近對(duì)照組水平(17.38±1.19 pg/ml)。Th2細(xì)胞因子IL-4的水平在處理后其分泌水平一直低于對(duì)照組(1

9、9.98±2.13 pg/ml),其中第3、4、5天的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.01),但是變化均在基線范圍內(nèi)。
　　 3、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量的檢測(cè)結(jié)果
　　 從黑大蒜提取物處理后的第3天到第7天,實(shí)驗(yàn)組小鼠NO2-始終處于較高的水平,與對(duì)照組相比(11.58±0.86μM),均具有顯著性差異(P<0.001)。
　　 4、脾細(xì)胞FasL mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果
　　 通過半定量RT-P

10、CR技術(shù)檢測(cè)了小鼠脾細(xì)胞FasL mRNA的表達(dá)水平。處理結(jié)束后的第1天至第7天,各天脾細(xì)胞FasL mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比均未見顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、黑大蒜提取物可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性。
　　 2、FasL mRNA的表達(dá)水平并未增高,提示黑大蒜提取物未誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞通過Fas/FasL,途徑發(fā)揮效應(yīng)。
　　 3、黑大蒜提取物可使脾細(xì)胞NO的分泌水平明顯增高,提示