羅哌卡因乳酸羥基乙酸共聚物微球在小鼠的體內(nèi)評價.pdf

1、研究背景和目的: 盡管目前國內(nèi)外在基礎(chǔ)及臨床的科學研究中都取得很大進步，但在疼痛治療方面仍有較大挑戰(zhàn)。局麻藥及其化合物在不同階段承擔著減輕或消除疼痛的角色，局部應(yīng)用局麻藥進行術(shù)后鎮(zhèn)痛是一種最直接有效的方法。局麻藥可以通過暫時可逆阻斷局部神經(jīng)傳導(dǎo)達到鎮(zhèn)痛效果。但臨床上所應(yīng)用的水溶性局麻藥不可能通過單次注射達到長時間的術(shù)后鎮(zhèn)痛及癌性疼痛等長時間鎮(zhèn)痛要求。目前時效最長的水溶性局麻藥一次給藥后的鎮(zhèn)痛時間不超過12小時。臨床上通常采用間斷

2、注射局麻藥或通過體內(nèi)導(dǎo)管植入持續(xù)給藥等方式達到長時間的鎮(zhèn)痛要求，但卻需要比較昂貴的設(shè)備及連續(xù)監(jiān)護，且給藥累積過多可導(dǎo)致呼吸及循環(huán)的抑制，并產(chǎn)生局麻藥中毒；長時間留置導(dǎo)管容易引起感染或?qū)Ч芤莆患按蛘?，所以這些方法并不是解決長時間鎮(zhèn)痛問題的最好途徑，因而需要探索出一種更優(yōu)化的方法。近三十多年來，乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）緩釋微球給藥系統(tǒng)是藥劑學研究的熱點。隨著藥物緩釋技術(shù)的發(fā)展，長時效局麻藥緩釋微球的制備已成為可能，將局部麻醉藥合成可控

3、制性釋放的制劑，通過單次給藥即能達到長時間鎮(zhèn)痛的要求，從而減少給藥次數(shù)，而且由于其緩慢而穩(wěn)定的釋放，使其血藥濃度低且波動小，大大降低了局部麻醉藥的毒性。 PLGA是一種生物可降解的合成高分子材料，由于其易合成、質(zhì)量穩(wěn)定、生物相容性好、生物降解可控性及其降解產(chǎn)物毒性低等優(yōu)點，是目前研究最多的可生物降解材料之一，其中間產(chǎn)物為乳酸，最終產(chǎn)物是水和二氧化碳，故無毒、無刺激并具有良好的生物相容性。近十多年來被廣泛應(yīng)用于微球控釋系統(tǒng)的骨架

4、材料，特別在微球埋植領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，部分藥品制劑已獲FDA批準并應(yīng)用于臨床。PLGA在一個月左右即可完全降解，特別適用于局麻藥這類半衰期短，在鎮(zhèn)痛方面又要求長時間應(yīng)用的藥物，進行緩釋系統(tǒng)的合成。國外有大量關(guān)于將PLGA應(yīng)用于利多卡因及布比卡因緩釋微球合成的研究報告，并發(fā)現(xiàn)均可達到緩釋及延長鎮(zhèn)痛時間的作用，但至今仍無關(guān)于將其應(yīng)用于羅哌卡因緩釋方面的研究報道。 鹽酸羅哌卡因（Ropivacaine，Rop）是一種新型局部麻醉藥，對

5、中樞神經(jīng)及心血管的潛在毒性低，更安全；感覺-運動阻滯分離程度高，被廣泛應(yīng)用于術(shù)后鎮(zhèn)痛、無痛分娩等。前期研究發(fā)現(xiàn)可成功合成羅哌卡因乳酸羥基乙酸共聚物微球（Rop-PLGA-MS），并在體外釋放實驗中發(fā)現(xiàn)其可緩慢釋放，一周內(nèi)可穩(wěn)定釋放80%羅哌卡因。然而只有體內(nèi)實驗才是檢驗制劑安全、可靠的方法。本研究主要通過Rop-PLGA-MS在小鼠的體內(nèi)釋放、藥效學及生物相容性三方面對Rop-PLGA-MS進行體內(nèi)評價，從而論證Rop-PLGA-MS的

6、研究價值。 方法： 1.Rop-PLGA-MS的體內(nèi)釋放研究：昆明小鼠60只，體質(zhì)量為20-22g。按前期研究方法制備Rop-PLGA-MS，并稱取50mg65份，隨機取5份作為對照組即0h組，其余分別埋植在60只小鼠皮下，按設(shè)定的時間間隔點（即植藥后1、2、3、6、12、24、48、72、96、120、144、168h）隨機分為12組，n=5。并在相應(yīng)的時間點處死相應(yīng)組小鼠，完整取出植入的Rop-PLGA-MS烘干后連

7、同0h組微球，分別加入2ml乙腈，經(jīng)過CL-2型恒溫磁力攪拌器（37度，40rpm）攪拌12小時→超聲溶解30s→取出50ul加入1ml甲醇中→蝸旋、離心5min→提取上清液等處理，所得樣品液均采用高效液相色譜法（HPLC）測定，根據(jù)標準曲線方程計算羅哌卡因剩余量及累積釋藥率（Q，%）。 2.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)的藥效學研究：昆明小鼠165只，體質(zhì)量為20-22g，隨機分成A、B、C三組（N=55），給藥側(cè)坐骨神經(jīng)旁

8、分別植入Rop-PLGA-MS、羅哌卡因PLGA空白微球混合物（Rop/PLGA-MS）及注射0.5%Rop（25mg/Kg）；對照側(cè)均植入PLGA空白微球（PLGA-MS），建立動物模型（每側(cè)植藥量均為400mg/Kg，給藥側(cè)均含等劑量羅哌卡因為25mg/Kg）。各組內(nèi)小鼠隨機均分為11個亞組（n=5），分布于給藥后5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、10h、18h、30h、48h11個時間點，采用熱踏板法及4-

9、point scale評分測定坐骨神經(jīng)阻滯時效；并在相應(yīng)時間點行小鼠眼眶采血0.5ml，給予高效液相色譜法（HPLC）測定血漿中Rop濃度。 3.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)的生物相容性研究：昆明小鼠10只，體質(zhì)量20-22g，隨機均分為A、B兩組，A組小鼠一側(cè)下肢手術(shù)切開暴露坐骨神經(jīng)，神經(jīng)周圍注入生理鹽水0.1ml后縫合；B組小鼠手術(shù)切開暴露坐骨神經(jīng)，其周圍均勻植入Rop-PLGA-MS（400mg/Kg）后縫合。以A組小

10、鼠為對照研究，采用小鼠手術(shù)切口的紅腫、滲出情況以及愈合時間（拆線后傷口處不再裂開，且無滲出）為指標考察兩組小鼠手術(shù)切口愈合情況；一周后比較兩組小鼠體質(zhì)量考察Rop-PLGA-MS對小鼠發(fā)育情況的影響；兩周后處死小鼠，比較兩組小鼠局部組織及全身主要臟器的病理學改變。 4.統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)及圖表均用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，實驗參數(shù)分別采用配對樣本t檢驗、One-Way ANOVA和Wilcoxon mean rank te

11、st，P<0.05具有統(tǒng)計學差異。 結(jié)果: 1.Rop-PLGA-MS的體內(nèi)釋放結(jié)果：Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)具有明顯的緩釋作用，第1小時內(nèi)可見明顯的突釋效應(yīng)，大部分Rop在3-48h期間穩(wěn)定釋放。6-24h是Rop-PLGA-MS釋放Rop的高峰時段，48小時內(nèi)釋放藥物達66.74±4.33%，48小時后藥物釋放趨于平緩，釋藥量較少，168小時內(nèi)釋放藥物91.83±1.31%。比較體內(nèi)釋放數(shù)學模型擬合中，以We

12、ibull分布函數(shù)擬合度最高，提示微球在體內(nèi)釋放明顯延遲，估計半衰期T1/2為42.26 h。經(jīng)Ritger-Peppas數(shù)學模型擬合表明其釋藥機制為藥物直接擴散+藥物基質(zhì)溶蝕的協(xié)同作用。 2.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)的藥效學研究結(jié)果 神經(jīng)阻滯結(jié)果：（1）感覺阻滯結(jié)果：A組小鼠在Rop-PLGA-MS坐骨神經(jīng)旁植入后3h，給藥側(cè)肢體開始出現(xiàn)明顯的感覺阻滯效果，較對照側(cè)肢體的熱疼痛反應(yīng)明顯遲鈍，10-18h達到阻滯

13、的高峰，P=0.000；48h后藥效消退，P>0.05。B、C兩組小鼠給藥側(cè)5min至2h對熱踏板基本無反應(yīng)（踏板撤腿潛伏時間多超過30s）P=0.000，4h后痛覺反應(yīng)恢復(fù)正常；各小鼠對照側(cè)肢體均無感覺阻滯效應(yīng)。（2）運動阻滯結(jié)果：小鼠對照側(cè)肢體均無運動阻滯現(xiàn)象；A組小鼠給藥側(cè)肢體3h時，80%運動阻滯評分為2分，20%為1分（P=0.151）；4h-18h可見輕微的運動阻滯（P<0.05）；30h時運動阻滯開始恢復(fù)（P=0.05），

14、48h基本恢復(fù)正常，各時間點各小鼠行走及步態(tài)均未見明顯異常。B組及C組小鼠給藥側(cè)肢體于5min-2h有較明顯的運動阻滯效應(yīng)，小鼠給藥側(cè)肢體出現(xiàn)拖腿現(xiàn)象；3h時80%運動阻滯評分為2分，20%為1分（P=0.317），運動阻滯無統(tǒng)計學差異。 血藥濃度測定結(jié)果：A組小鼠3h起血漿中可測及微量Rop，10h至18h緩慢達到相對峰值（Cmax），為129.80±22.59ng/ml和120.20±23.35ng/ml，其后緩慢而平穩(wěn)地下

15、降，藥物留置時間近30小時。B、C兩組在5min時血漿即可測及較高濃度Rop，30min快速達到Cmax為1559.00±253.39ng/ml和1470.80±113.77ng/ml，其后快速下降，藥物留置時間小于4小時。 3.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)的生物相容性研究結(jié)果：兩組小鼠局部手術(shù)切口均未見紅腫反應(yīng)及明顯滲出；一周內(nèi)發(fā)育情況無統(tǒng)計學差異；兩周后病理切片所見，各小鼠心、腦、肺、肝、胰、脾均未見明顯組織結(jié)構(gòu)異常及各

16、種病理學改變；Rop-PLGA-MS植入側(cè)周圍肌肉結(jié)締組織僅見輕微炎癥反應(yīng)，未見感染、組織細胞壞死及組織纖維化等反應(yīng)，組織結(jié)構(gòu)完整，周圍可見部分巨噬細胞吞噬，對照組小鼠局部組織也可見輕度炎癥反應(yīng)，但周圍未見巨噬細胞吞噬。 結(jié)論: 我們對Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)進行釋放、藥效及生物相容性的考察得出以下結(jié)論： 1.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)具有緩慢而穩(wěn)定地釋放，其釋放特點可分三階段說明：①0-3h時間段

17、藥物有一定量的釋放，第一小時釋放速率最快，是微球突釋的時間段；②3-48h時間段藥物大量釋放，是微球釋藥的擴散+微球溶蝕釋藥階段；③48-168h時間段藥物釋放極為緩慢穩(wěn)定一般為微球基質(zhì)溶蝕釋藥階段。 2.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)可有效延長Rop時效達10倍以上；血藥濃度低，Cmax為Rop和Rop/PLGA-MS給藥組的1/10以下；藥物生物利用度增加，毒性小。 3.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)具有較好的組