重癥肌無力患者胸腺組織共刺激分子B7-H1-B7-DC—PD-1表達的研究.pdf

1、研究背景及目的：重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是主要累及神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor,AChR),主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody,AChRab)介導、細胞免疫(cell-mediated immunity,CMI)依賴、補體參與的自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。大量文獻證實

2、MG患者外周血T淋巴細胞亞群異常,經(jīng)AChR刺激后細胞因子的產(chǎn)生也有異常變化,這些結果表明MG患者存在細胞免疫和體液免疫的異常。同時,由于70％-80%MG患者胸腺異常(包括胸腺增生和胸腺瘤),而且胸腺切除術是有效治療MG的手段之一,因而MG與胸腺異常有關成為共識?？乖禺愋訲細胞的活化需要兩個不同的信號。其中,第一信號來自抗原肽—MHC(major histocompatibility complex,主要組織相容性復合體)分子組成的

3、復合物與TCR(T cell receptor,T細胞受體)的相互作用;第二信號由抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APC)表面表達的共刺激分子傳遞給T細胞。近十幾年的研究表明,共刺激信號可促進T細胞生長、分化和細胞因子的產(chǎn)生,以及為防止T細胞發(fā)生凋亡提供生存信號。更重要的是,由于共刺激信號可以成為增強或終止免疫應答的一種手段,因而已日益受到關注。近年來新發(fā)現(xiàn)的共刺激途徑B7-H1/B7-DC-PD-1對已

4、經(jīng)活化的效應性T細胞具有重要的調(diào)節(jié)作用。B7-H1因為能夠通過與T細胞表面不同的特異性受體結合調(diào)節(jié)T細胞的分化和激活作用,因而成為新近研究熱點。一方面,B7-H1可以在抗CD3抗體或異種抗原刺激下與相應的配體PD-1結合促進人T細胞增殖和促進IL-10分泌。另一方面,如用B7-H1刺激T細胞,可抑制TCR介導的細胞增殖和細胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN—γ的產(chǎn)生,導致細胞周期停止。B7-H1在這種T細胞應答中發(fā)揮負向調(diào)控作

5、用。本研究利用免疫組化、分子生物學和流式細胞術(flow cytometry,FCM)等實驗手段,對MG患者胸腺組織進行B7-H1表達的檢測,并檢測B7-H1/B7-DC-PD-1共刺激信號通路分子的表達處于異常狀態(tài),提示異常的共刺激信號與MG密切相關。研究B7-H1/B7-DC-PD-1共刺激信號通路對MG患者細胞免疫的調(diào)控作用,探討該信號傳導通路在MG發(fā)生中的作用,可為診斷、預防和治療MG提供依據(jù)。
　　方法：無菌取臨床確診的

6、21例重癥肌無力(MG)患者和10例先天性心臟病患者切除的胸腺組織,分別進行如下實驗:1.制作冰凍切片,免疫組化方法檢測胸腺組織中B7-H1分子的表達;2.提取胸腺組織總RNA,RT-PCR分別擴增B7-H1、B7-DC、PD-1和內(nèi)參β-actin基因,1.2%瓊脂糖凝膠電泳,利用Quantity One(?)4.6.3凝膠圖像分析軟件,測定B7-H1、B7-DC、PD-1和內(nèi)參β-actin基因電泳條帶灰度值,計算B7-H1、B7-

7、DC、PD-1基因條帶灰度值與相應標本β-actin基因條帶灰度值的比值,作為該例標本目的基因mRNA的相對表達量。利用統(tǒng)計學軟件SPSS11.0,比較目的基因在MG患者和正常對照胸腺組織的表達情況;3.機械分離胸腺細胞,采用流式細胞術檢測胸腺細胞表面B7-H1分子的表達。
　　結果：1.免疫組化結果顯示:MG組與正常組相比較B7-H1蛋白表達明顯減少,表達量差異具有統(tǒng)計學意義(χ~2=4.19,p<0.05)。2.采用成組資料t

8、檢驗,MG組(n=21)B7-H1mRNA相對表達水平為0.394±0.258,和對照組(n=10,0.144±0.144)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MG組(n=21)B7-DCmRNA表達水平為0.710±0.080,和對照組(n=10,0.647±0.058)相比,差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。3.成組設計兩樣本t檢驗比較,MG患者中不同病理分型的B7-H1 mRNA和B7-DC mRNA的表達水平之間差異無明顯統(tǒng)

9、計學意義。其中增生型和萎縮型之間兩者p值分別為0.057和0.822,按照檢驗水準α=0.05,差異無顯著統(tǒng)計學意義。4.流式細胞儀檢測結果表明,MG組和對照組胸腺細胞表面均表達B7-H1分子,與正常對照組胸腺細胞B7-H1分子表達陽性率(n=11,33.48±2.05)相比較,伴胸腺瘤MG組B7-H1分子表達(n=2,40.09±1.98)顯著增高,胸腺萎縮組(n=5,32.17±1.79)則變化不大,而增生型MG組B7-H1分子的表