LRIG2基因全長及胞外段對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響及其機制.pdf

1、第一部分 LRIG2全長及胞外段慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的亞細(xì)胞定位
　　目的：構(gòu)建LRIG2基因全長及胞外段的慢病毒表達(dá)載體,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系,并觀察其蛋白的亞細(xì)胞定位。
　　方法：PCR擴增LRIG2基因全長(LRIG2)和胞外段(LRIG2ecto)片段,運用基因重組技術(shù)分別將片段插入慢病毒表達(dá)載體pLVX-Puro-3×Flag;將測序成功的載體pLVX-Puro-3×Flag-LR

2、IG2和pLVX-Puro-3×Flag-LRIG2ecto包裝成慢病毒后分別轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87,U251;嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株。WesternBlot和Real-timeRT-PCR檢測穩(wěn)定株中LRIG2蛋白和mRNA的表達(dá)。激光共聚焦檢測LRIG2全長及胞外段蛋白的亞細(xì)胞定位。
　　結(jié)果：LRIG2全長及胞外段重組質(zhì)粒測序序列完全正確。成功得到過表達(dá)LRIG2及LRIG2ecto的U87,U251穩(wěn)定株,U87中LR

3、IG2及LRIG2ecto過表達(dá)組相應(yīng)的mRNA表達(dá)分別是對照組的8.42±0.50和29.58±0.98倍;U251中分別是對照組的65.83±4.14和126.34±0.98倍(P<0.01)。免疫熒光顯示在U87及U251中,LRIG2及LRIG2ecto均主要是在胞漿表達(dá),未見細(xì)胞核區(qū)的表達(dá)。
　　結(jié)論：成功建立穩(wěn)定表達(dá)外源性LRIG2基因全長及胞外段的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株,過表達(dá)產(chǎn)物主要定位于胞漿。
　　第二部分

4、LRIG2全長及胞外段對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系增殖和凋亡的影響及其機制
　　目的：探討過表達(dá)LRIG2全長(LRIG2)及胞外段(LRIG2ecto)基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87,U251增殖、凋亡的影響及其機制。
　　方法：通過CCK8法檢測細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性,免疫熒光染色檢測Ki67的表達(dá),PI染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化,WesternBlot檢測細(xì)胞周期蛋白,EGFR信號通路相關(guān)蛋白及PDGFRβ,cMet蛋白的表

5、達(dá),AnnexinV-FITC/PI雙染后行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,JC-1染色后行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位。
　　結(jié)果:與對照組相比,LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組U87,U251細(xì)胞增殖率均明顯高于對照組,Ki67陽性細(xì)胞百比分均明顯高于對照組,細(xì)胞周期檢測細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)均明顯高于對照組。在U87細(xì)胞中,LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率分別為(2.86±0.30)％,(4.04±0.59)%

6、,明顯低于對照組的(5.9±0.45)%;在U251細(xì)胞中,LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率分別為(4.12±0.26)%,(3.62±0.24)%,明顯低于對照組(5.48±0.65)%。在含血清培養(yǎng)條件下,LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組U87,U251細(xì)胞中EGFR及磷酸化EGFR水平表達(dá)增加,其下游的磷酸化Akt及磷酸化Erk表達(dá)水平均較對照組明顯增加;在無血清培養(yǎng)及EGF刺激作用下,刺激時間為5min時,

7、LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組中磷酸化EGFR及磷酸化Akt的表達(dá)水平較對照組明顯增高。在EGFR抑制劑吉非替尼作用下,LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)明顯增強U87,U251細(xì)胞存活率,增加U251細(xì)胞線粒體膜電位及降低其細(xì)胞凋亡率。LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)U87細(xì)胞PDGFRβ表達(dá)明顯增加;LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組U87,U251細(xì)胞cMet表達(dá)明顯增加。
　　結(jié)論:LRIG2基因全長及胞

8、外段均可促進(jìn)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,增強酪氨酸激酶受體EGFR,PDGFRβ及cMet表達(dá),激活EGFR及下游信號通路,增強對EGFR抑制劑的治療抵抗,有望成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤新的分子治療靶點。
　　第三部分 LRIG2全長及胞外段對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系遷移和侵襲的影響
　　目的:探討過表達(dá)LRIG2全長(LRIG2)及胞外段(LRIG2ecto)基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系遷移和侵襲的影響。
　　方法:劃痕實驗檢測

9、細(xì)胞遷移,Transwell小室侵襲實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力,明膠酶譜檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的表達(dá),real-timeRT-PCR檢測MMP2mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組U251細(xì)胞48h遷移像素分別為:(7.61±0.32)×105和(8.34±0.42)×105,明顯小于對照組細(xì)胞(10.17±0.31)×105。U87中,LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組侵襲細(xì)胞

10、數(shù)分別為(49.38±4.21)%和(59.49±6.02)%,明顯低于對照組細(xì)胞(100±9.11)%;U251中,LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(36.7±4.09)%和(49.54±5.81)%,明顯低于對照組細(xì)胞(100±10.01)%。U87,U251中LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組培養(yǎng)基中MMP2的活性均明顯低于相應(yīng)對照組細(xì)胞,U251中LRIG2及LRIG2ecto過表達(dá)組MMP-2mRNA