凋亡腫瘤細胞負載的樹突狀細胞疫苗抗肺癌的實驗研究.pdf

1、第一部分凋亡腫瘤細胞負載的樹突狀細胞疫苗抗肺癌的實驗研究 背景與目的：樹突狀細胞(dendriticcells,DCs)是目前已知功能最強的專職抗原呈遞細胞，并能有效刺激初始免疫應(yīng)答和記憶免疫應(yīng)答，是啟動、調(diào)控并維持特異性免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。腫瘤患者體內(nèi)往往存在DCs功能缺陷，無法有效的提呈腫瘤抗原給T細胞，造成了免疫忽視或免疫逃逸，從而促進了腫瘤生長。通過體外制備腫瘤抗原特異性的DCs疫苗回輸體內(nèi)可能會改變這一狀況。本實驗從健

2、康人外周血中誘導DCs，通過凋亡腫瘤細胞負載聯(lián)合CD40單抗促進DCs成熟構(gòu)建DCs疫苗，并用DCs疫苗激活抗原特異性的細胞毒性T細胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)，觀察其體內(nèi)外抗肺癌的特性。 方法：采用常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，培養(yǎng)2小時后貼壁細胞采用含GM-CSF(100~g／L)、IL-4(50~g

3、／L)、10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)DCs，在DCs培養(yǎng)的第6天，以誘導凋亡的A549進行抗原負載(DCs：凋亡細胞=5：1)，24h后加入激發(fā)型CD40單克隆抗體(5mg／L)繼續(xù)誘導2d，誘導DCs成熟；收集成熟的DCs與自體T細胞按l：50的比例混合共育7天，誘導抗原特異性的CTL細胞；流式細胞儀檢測細胞表型變化；四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細胞毒活性；于裸鼠的的右腋皮下注射處于對數(shù)生長期的A549細胞5×106個／0．

4、2ml，第16天選擇荷瘤大小相似的裸鼠12只隨機分為2組，每組6只。①生理鹽水對照組：給予腫瘤局部注射生理鹽水0．2ml作為空白對照；②CTL治療組：給予腫瘤局部注射CTL1×107個／0．2ml；每周治療1次，連續(xù)治療3次。從治療開始每7d測量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b)1次，腫瘤體積=0．5×a×b2，觀察腫瘤生長的情況。 結(jié)果：凋亡腫瘤細胞負載可使DCs上調(diào)表達CDla、CD80、CD83、CD86和HLA-DR，

5、聯(lián)合CD40mAb可進一步促進DCs的成熟；成熟DCs和自體的T細胞共育活化生成抗原特異性CTL；與未活化前相比，CTL的CD8+T細胞大幅度上調(diào)，并上調(diào)表達CD3、CD25、CD28、CD8／CD28分子；CTL對A549具有高效特異的殺傷力，明顯強于CTL對肝癌細胞HepG2的作用(P

6、照組腫瘤結(jié)節(jié)生長較快，CTL組腫瘤生長明顯受抑制，接種肺癌細胞A549第44天后對照組、CTL組兩組腫瘤體積分別為(0．68±O．n)cm3、(O．14±O．10)cm3，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P

7、ine-inducedkiller,CIK)細胞同時表達CD3和CD56兩種膜表面分子，具有增殖活性高、殺瘤活性強、殺瘤譜廣及對正常骨髓造血影響輕微等多種優(yōu)點，被認為是新一代過繼免疫治療的首選方案。樹突狀細胞(dendriticcells,DCs)是體內(nèi)最強的抗原呈遞細胞，能有效刺激初始免疫應(yīng)答和記憶免疫應(yīng)答，并且能夠提高效應(yīng)細胞的抗瘤活性。本實驗將DCs和CIK細胞共培養(yǎng)，觀察共培養(yǎng)的DCs和CIK細胞(DC-CIK細胞)的細胞表型、

8、增殖活性及體內(nèi)外的抗肺癌作用。 方法：采用常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，培養(yǎng)2小時后貼壁細胞采用含GM-CSF(100~g／L)、IL-4(50~g／L)、10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)DCs，在DCs培養(yǎng)的第6天，以誘導凋亡的A549進行抗原負載(DCs：凋亡細胞=5：1)，24h后加入激發(fā)型CD40單克隆抗體(5mg幾)繼

9、續(xù)誘導2d，誘導DCs成熟；收集非粘附性細胞(pefipherflbloodlymphocyte，PBL)，第O天添加IFN-71000U/ml，第1天添加抗CD3單抗250ng/ml、IL-2300U/ml。每3天調(diào)整細胞密度，更換培養(yǎng)基，并補加IL-2300U/ml：將成熟的DCs和培養(yǎng)9天的CIK細胞按1：10比例共培養(yǎng)5天獲得DC-CIK細胞。流式細胞儀測DC-CIK細胞表型CD3、CD25、CD4、CD8、CD56的變化，四甲

10、基偶氮唑鹽(MTT)法測定其體外的細胞毒活性；于BALB／C裸鼠的的右腋皮下注射處于對數(shù)生長期的A549細胞5×1003'／只，第16天選擇荷瘤大小相似的裸鼠18只隨機分為3組：①生理鹽水對照組；②CIK治療組；③CIK-DC治療組，每組6只。治療組于腫瘤局部注射相應(yīng)的效應(yīng)細胞1×107個／只，體積均為0．2ml／R，對照組于腫瘤局部注射生理鹽水0．2ml／只；每周治療1次，連續(xù)治療3次。從治療開始每7天用游標卡尺測量腫瘤的最大縱徑(a