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文檔簡介
1、本研究為了獲得具廣譜和持久抗性的水稻新種質(zhì),抵抗壞死營養(yǎng)型病原菌誘發(fā)的多種病害和生產(chǎn)過程中的多種逆境,利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法首次將來源于昆蟲桿狀病毒的細胞凋亡抑制基因Op-iap和p35導入水稻中。 依目的基因編碼區(qū)序列設計了三對引物,從昆蟲表達載體pIE1-4opiap和pIE1-4p35中擴增了細胞凋亡抑制基因iap和p35。Op-iap基因的編碼區(qū)長807bp,編碼一個由268個氨基酸組成的,分子量約為30kDa具有抑制細胞
2、凋亡功能的蛋白;p35基因長為900bp,編碼一個由299個氨基酸組成的,分子量約為35kDa的具有抑制細胞凋亡功能的蛋白。將兩個基因單獨及其組合分別插入pCAMBIA1301,構建了三個植物表達載體p1301-iap、p1301-p35和p1301-iap-p35,經(jīng)PCR檢測、酶切鑒定和核苷酸序列測定等分析確認構建無誤。 利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法通過構建的載體將目的基因和對照(gus基因)導入粳稻品種“中花8號”、“中花10號”
3、和“Aichiasahi”,共獲得轉(zhuǎn)基因水稻485株。經(jīng)Southern-blot、Northern-blot和RT-PCR分析,導入的基因已整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中,并轉(zhuǎn)錄了完整的mRNA。利用PCR擴增結果對T1代的外源基因分離進行了遺傳分析,結果表明:目的基因在T1代中符合孟德爾分離比例,并與選擇標記基因緊密連鎖。 接種立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)并調(diào)查轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)病級別,計算平均病級及病情指數(shù)。接
4、種20天時,提取病斑周圍組織的DNA,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察細胞凋亡的典型標志DNA片段化。觀察、計算及統(tǒng)計分析結果顯示,導入了細胞凋亡抑制基因的“中花8號”T0代植株能夠抑制壞死營養(yǎng)型病原真菌侵染誘發(fā)的細胞凋亡,顯著地提高了受體品種對稻紋枯病的抗性。 轉(zhuǎn)細胞凋亡抑制基因水稻的T1代幼苗能夠抑制在低溫、弱光、短日照等不良環(huán)境條件下由立枯絲核菌(Rhizoctonisolani)侵染誘發(fā)的細胞凋亡,顯著地提高了秧苗的存活率和抗
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