肝再生增強(qiáng)因子競爭抑制檢測方法的建立及臨床初步應(yīng)用.pdf

1、目的：肝再生增強(qiáng)因子(Augmenterofliverregeneration，ALR)是Hagiya等于1994年對肝刺激因子(Hepaticstimulatorysubstance，HSS)的研究中發(fā)現(xiàn)的一種非特異性、具有熱穩(wěn)定性、不同于肝細(xì)胞生長因子(Hepatocytegrowthfactor，HGF)的促肝細(xì)胞再生因子。為進(jìn)一步了解血清中人肝再生增強(qiáng)因子(Humanaugmenterofliverregeneration，hA

2、LR)的含量，研究hALR與不同程度肝病，尤其是與乙型肝炎不同階段的關(guān)系，依據(jù)經(jīng)典免疫學(xué)理論，我們擬建立一種不同于以往雙抗體夾心法或間接ELISA方法的、適用于檢測hALR這種小分子蛋白質(zhì)的可靠檢測方法。本研究擬采用直接競爭的反應(yīng)模式來建立hALR的血清檢測方法。通過制備hALR的原核表達(dá)純品，用辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP)及銪元素(Europium，Eu)標(biāo)記，為競爭抑制檢測方法的建立提供抗原；

3、利用抗hALR的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，制備并擴(kuò)增小鼠抗hALR的單克隆抗體(Monoclonalantibody，McAb)；進(jìn)而建立血清hALR直接競爭的檢測方法，了解不同肝病患者血清中hALR的含量及意義。 方法： 1．抗原及標(biāo)記抗原的制備 (1)hALR的原核表達(dá)：鑒定重組質(zhì)粒pQE30-hALR，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SGl3009，在異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1．thio-β-D,gal

4、actoside，IPTG)誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)15％SDS-PAGE鑒定； (2)hALR的親和層析純化：用鎳離子親合層析柱(Ni-nitrilotriaceticacidresin，Ni-NTA)對表達(dá)產(chǎn)物hALR蛋白進(jìn)行純化，用15％SDS-PAGE及毛細(xì)管電泳(Capillaryelectrophoresis,CE)鑒定； (3)hALR的標(biāo)記：采用改良過碘酸鈉法及DTTA螯合法分別用HR?及Eu標(biāo)記hALR蛋

5、白純品，標(biāo)記產(chǎn)物用15％SDS-PAGE及時(shí)間分辨熒光測定儀(time-resolvedfluorescenceimmunoassay,TR-FIA)鑒定。 2．抗體制備及鑒定 培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室建株的抗hALR的雜交瘤細(xì)胞AAMA，用ELISA方法鑒定其培養(yǎng)上清；將該雜交瘤細(xì)胞對BALB／c小鼠作腹腔接種，用SP2／0骨髓瘤細(xì)胞作陰性對照，收獲腹水后，用ELISA方法和免疫印跡方法鑒定該McAb與hALR蛋白的反應(yīng)性，并對其

6、亞型進(jìn)行分類；用免疫印跡方法進(jìn)一步檢測該McAb對真核細(xì)胞表達(dá)的hALR及人血白蛋白的反應(yīng)性。 3．建立檢測方法及臨床應(yīng)用 采用抗原直接競爭法，抗hALRMcAb作固相包被，hALR蛋白純品作標(biāo)準(zhǔn)品，分別與HRP—hALR和Eu—hALR競爭反應(yīng)，用酶標(biāo)儀及TR-FIA檢測結(jié)果，分別繪制兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線；再以不同程度肝病患者的血清標(biāo)本代替蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，分別與HRP—hALR和Eu—hALR競爭反應(yīng)，檢測結(jié)果用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

7、作回歸分析，計(jì)算血清中hALR含量，共檢測不同程度的肝病患者血清標(biāo)本1.00例。 結(jié)果： 1．抗原及標(biāo)記抗原制備結(jié)果 重組質(zhì)粒pQE30-hALR在宿主菌中得到高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量約為16KD，該蛋白經(jīng)親合層析純化后SDS-PAGE鑒定為單一條帶，經(jīng)CE鑒定純度達(dá)90％。3H-TdR摻入法檢測證實(shí)該蛋白純品對人肝癌細(xì)胞株QGY有促增殖的生物學(xué)活性。HRP標(biāo)記產(chǎn)物用SDS-PAGE鑒定可見約60KD的明顯蛋白條

8、帶，Eu標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)檢測其熒光值>400萬／10ul。 2．抗體制備及鑒定結(jié)果 用ELISA方法檢測抗hALR雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中所含抗體能與hALR蛋白反應(yīng)，與SP2／0細(xì)胞上清比較，P／N>2．1。對收獲的抗hALRMcAb腹水，用ELISA方法測定最佳工作濃度為1：800，免疫印跡方法見該McAb與hALR蛋白反應(yīng)后呈單一條帶，而不與陰性對照蛋白反應(yīng)；其亞型分類同為IgG2b。該McAb能對真核細(xì)胞表達(dá)的hALR

9、發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)，且與人體血清中廣泛存在的天然蛋白人血白蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)。 3．建立血清檢測方法及應(yīng)用結(jié)果 用HRP標(biāo)記和Eu標(biāo)記兩種方法所建立的直接競爭檢測方法，能檢測到的最低限分別為2ng／ml和lng／ml，在200ng／ml范圍內(nèi)，其反應(yīng)均呈良好的線性關(guān)系，兩種方法檢測結(jié)果基本一致，比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0．05)。在檢測的100例肝病血清中，其中重型肝炎組hALR血清含量最高，其次為急性肝炎組，肝炎后肝

10、硬化組和慢性肝炎組的標(biāo)本hALR血清含量也明顯高于原發(fā)性肝癌和正常對照組含量(F<0．01)，而原發(fā)性肝癌組與正常對照組hALR血清含量無明顯差異(p>0．05)。 結(jié)論： 成功純化并標(biāo)記了原核表達(dá)的hALR蛋白，大量制備了鼠抗hALR的MoAb，為競爭抑制方法的建立提供了必要的條件，同時(shí)也為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。建立了兩種標(biāo)記法的直接競爭檢測方法，對于不同肝病患者血清hALR含量的檢測具有良好的敏感性及特異