新型苯并噁嗪衍生物ABO靶向Annexin A7和抑制動脈硬化的機(jī)制研究.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)遍布機(jī)體全身，位于血管壁的最內(nèi)層。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要誘因之一。適中水平的自噬可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞抵御環(huán)境脅迫。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)可能為預(yù)防和治療動脈粥樣硬化提供新的方案。
　　 VEC自噬的發(fā)生與多種細(xì)胞不同。多種細(xì)胞在血清饑餓時發(fā)生自噬，而VEC在血清饑餓條件下會迅速發(fā)生凋亡，而且VEC在體內(nèi)通常與血液接觸，因此，

2、VEC的自噬具有明顯的細(xì)胞特異性，利用血清饑餓誘導(dǎo)研究內(nèi)皮細(xì)胞自噬的分子機(jī)制比較困難。因此，尋找正常培養(yǎng)條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)劑對深入了解其自噬機(jī)理具有重要意義。
　　 在我們實驗室的前期工作中，發(fā)現(xiàn)一種新型苯并噁嗪衍生物-2，3-氫-3-羥甲基-6-氨基-1，4-苯并噁嗪(ABO)能夠抑制血清饑餓和氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的VEC凋亡。此外，ABO可以通過上調(diào)膜聯(lián)蛋白A7(Annexin A7，ANXA7)，促進(jìn)ANXA7

3、與微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain3，LC3)和粒鈣蛋白(grancalcin，GCA))相互作用，促進(jìn)正常培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬。這些研究結(jié)果說明ABO是一種良好的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)劑和自噬誘導(dǎo)劑。但是ABO調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的具體機(jī)制還不清楚。ANXA7具有鈣離子依賴的GTPase活性，ANXA7的磷酸化與其GTPase活性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，并且直接影響ANXA7和其

4、它蛋白的相互作用。LC3的脂化是自噬發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。最近研究表明，12位絲氨酸是LC3上新發(fā)現(xiàn)的一個磷酸化位點，這一位點的磷酸化會抑制LC3的脂化。此外有研究表明，168位絲氨酸殘基是GCA上一個可能的磷酸化位點。那么，ABO是否直接靶向ANXA7，能否調(diào)節(jié)ANXA7及其相互作用蛋白的磷酸化，以及在體內(nèi)，ABO是否能發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，抑制動脈硬化發(fā)展的作用還不清楚。
　　 磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(Phosphatidylcho

5、line-specific Phospholipase C，PC-PLC)與內(nèi)皮損傷和動脈硬化的發(fā)展密切相關(guān)。PC-PLC的結(jié)合蛋白—磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1(phosphatidylethanolamine binding protein1，PEBP1)是一種重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。在動脈硬化過程中，ANXA7與PC-PLC和PEBPl的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。
　　 據(jù)上述背景，本論文旨在利用ABO研究血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬和動脈粥

6、樣硬化發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)機(jī)制，為闡明VEC自噬的調(diào)控機(jī)制提供新的實驗證據(jù)，為治療動脈粥樣硬化提供先導(dǎo)化合物和新靶點。
　　 1.新型苯并噁嗪衍生物ABO促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬分子機(jī)制的研究
　　 1.1 ABO靶向ANXA7，并抑制ANXA7的磷酸化
　　 首先我們利用免疫沉淀的方法發(fā)現(xiàn)ABO以濃度依賴的方式抑制ANXA7與其抗體的結(jié)合，而不影響Cherry抗體與Cherry-ANXA7融合蛋白的結(jié)合，表明ABO直接與

7、ANXA7結(jié)合，這一結(jié)合抑制ANXA7抗體與ANXA7的結(jié)合。此外，我們還發(fā)現(xiàn)ABO可以抑制ANXA7蘇氨酸殘基的磷酸化水平。通過定點突變，我們發(fā)現(xiàn)286位蘇氨酸殘基是ANXA7一個重要的磷酸化位點，ABO直接靶向286位蘇氨酸殘基，可能抑制了該位點的磷酸化。
　　 1.2 ABO抑制ANXA7相互作用蛋白的磷酸化
　　 我們之前研究結(jié)果表明，ANXA7與GCA和LC3存在相互作用，并且ABO可以促進(jìn)ANXA7與LC3的

8、相互作用。在本實驗中我們利用免疫熒光共染法發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外，ABO均可以促進(jìn)ANXA與GCA的相互作用。此外，通過免疫沉淀和western blot檢測，我們發(fā)現(xiàn)ABO和ANXA7 knockdown均可以有效地抑制GCA和LC3的磷酸化。
　　 2.新型苯并噁嗪衍生物ABO抑制apoE-/-小鼠動脈硬化發(fā)展和促進(jìn)斑塊穩(wěn)定的分子機(jī)制研究
　　 2.1 ABO抑制apoE-/-小鼠動脈硬化發(fā)展并提高斑塊穩(wěn)定性
　　 我

9、們隨機(jī)挑選一批八周齡apoE-/-雄性小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)14周。在22周處死基準(zhǔn)組小鼠，其他三組分別腹腔注射不同劑量ABO或無菌DMSO和PBS，處理8周后處死，收集小鼠主動脈、頭臂動脈和血液備用。組織形態(tài)學(xué)分析表明:ABO處理組小鼠整條血管，以及頭臂動脈處和主動脈竇處的斑塊面積均小于對照組。Masson膠原纖維染色顯示:ABO處理組小鼠主動脈竇處斑塊內(nèi)膠原含量大于對照組;免疫熒光結(jié)果顯示:ABO處理組小鼠的主動脈竇處斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量

10、小于對照組，平滑肌細(xì)胞含量大于對照組;原位明膠酶譜法測定基質(zhì)金屬蛋白酶活性結(jié)果顯示:ABO處理組小鼠的主動脈竇處斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9的活性低于對照組。TUNEL染色和HE染色顯示:ABO處理組小鼠斑塊中細(xì)胞凋亡率和壞死程度均顯著低于對照組。此外，為了檢測ABO的副作用，我們對小鼠進(jìn)行體重跟蹤和臟器系數(shù)分析，結(jié)果表明各組別小鼠之間沒有顯著差異。綜上說明，ABO抑制動脈硬化斑塊的發(fā)展，并提高斑塊的穩(wěn)定性。
　　 2.2 AB

11、O抑制apoE-/-小鼠動脈硬化發(fā)展并提高斑塊穩(wěn)定性的機(jī)制研究
　　 首先，我們發(fā)現(xiàn)ABO對小鼠血脂含量沒有影響。然后，我們利用透射電子顯微鏡和en face免疫熒光觀察主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中自噬小體結(jié)構(gòu)以及LC3的點狀分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABO可以促進(jìn)斑塊內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬。此外，免疫熒光染色還顯示:ABO處理組小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中p62的蛋白水平顯著低于對照組，說明體內(nèi)注射ABO促進(jìn)斑塊內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬，且自噬流是完整的。通過TUNEL染色和H

12、&E染色，我們發(fā)現(xiàn)ABO顯著降低斑塊內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，說明ABO發(fā)揮保護(hù)斑塊內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
　　 與之前的體外實驗一致，ABO顯著提高斑塊內(nèi)皮細(xì)胞中ANXA7的水平。此外，ABO處理還可以降低斑塊內(nèi)皮細(xì)胞和血清中PC-PLC的水平和活性。體外實驗表明ABO抑制oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞對IL-6和IL-8的分泌，并可以促進(jìn)ANXA7與PC-PLC相互作用抑制PC-PLC的活性。PC-PLC相互作用蛋白PEBP1參與到多種疾病中。