乙酰吉他霉素對豬鏈球菌病的PK-PD同步模型研究.pdf

1、在過去的十年中，養(yǎng)豬行業(yè)中豬鏈球菌感染被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)豬呼吸道疾病主要的病原菌之一。豬鏈球菌的天然宿主是豬的上呼吸道、扁桃體、鼻腔，能引起腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀，不僅可以感染動物，還可以感染人。由于在治療豬鏈球菌感染的首選藥物青霉素的耐藥問題越來越嚴(yán)重，現(xiàn)在越來越多的大環(huán)內(nèi)酯類藥物被用于醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床。乙酰吉他霉素是一種16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物，還沒有在獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用。目前由于獸醫(yī)臨床上藥物濫用亂用現(xiàn)象嚴(yán)重，不能達到最佳的給藥效

2、果，治療失敗的同時導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。為了避免或者盡量減少此種現(xiàn)象的發(fā)生，PK-PD模型將被引入到給藥方案的制定中。PK-PD模型能反映宿主機體、病原微生物、藥物三者之間的相互關(guān)系，從而來制定合理的給藥方案。本課題擬將通過研究乙酰吉他霉素對豬鏈球菌的體外藥效學(xué)(in-vitro PD)、間接體內(nèi)藥效學(xué)(ex-vivo PD)，通過電子支纖維鏡直接在肺部進行采樣，建立半體內(nèi)模型，研究肺部藥動學(xué)，將體內(nèi)肺部藥動學(xué)和半體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)合起來，并通過

3、軟件模擬驗證給藥劑量。
　　1.乙酰吉他霉素對豬鏈球菌的藥效學(xué)試驗
　　參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文件，采用微量肉湯稀釋法，測定乙酰吉他霉素及分離出來的5個主要單組分在肉湯和肺泡液中對臨床分離的豬鏈球菌1607(2型)的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，結(jié)果表明乙酰吉他霉素及5個主要的單組份A6A7、A5′、A4A5、A1A3、A13對1607(2型)MIC均為1μg/mL，MBC

4、均為2μg/mL，說明在乙酰吉他霉素在肉湯和肺泡液中有相同的抗菌活性，差異性不大；同時測定乙酰吉他霉素的主要代謝產(chǎn)物吉他霉素 A7、A6、A5、A4、A1、A3、A13七個組分，對豬鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度(MBC)分別為2μg/mL，8μg/mL；通過平板涂布方法測得乙酰吉他霉素對豬鏈球菌的最小防耐藥突變濃度MPC為5μg/mL；將豬鏈球菌1607(2型)暴露在不同濃度的乙酰吉他霉素1h、2h后，測定豬鏈球菌與不同

5、濃度的乙酰吉他霉素接觸1h、2 h后的抗菌后效應(yīng)，豬鏈球菌與2 MIC和4 MIC暴露1h的抗菌后效應(yīng)是1.59 h、1.88 h，豬鏈球菌與2 MIC和4 MIC暴露兩個小時的抗菌后效應(yīng)是2.33 h、2.96 h，說明乙酰吉他霉素對豬鏈球菌有較長的抗菌后效應(yīng)；根據(jù)測定的MIC結(jié)果，設(shè)置不同濃度的乙酰吉他霉素藥物濃度(0 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC、16 MIC、32 MIC、64 MIC)

6、繪制對豬鏈球菌的體外抑菌曲線，通過抑菌曲線可以看出乙酰吉他霉素的殺菌特點表現(xiàn)為較長PAE的時間依賴性，隨著時間的增加，抗菌作用效果逐漸增強，同時隨著藥物濃度的增加，抑菌作用效果逐漸增強，也表現(xiàn)為一定的濃度依賴性；將不同時間點采集的肺泡液，離心過濾后，與細(xì)菌孵育，繪制半體內(nèi)的殺菌曲線，與體外的殺菌曲線相似，都表現(xiàn)為較長PAE的時間依賴型，和一定的濃度依賴性。在健康豬的半體內(nèi)殺菌曲線中可以看出在1h、2h、4h、6h、8h有較強的抗菌活性，

7、隨著時間的延長抗菌活性增強，在患病豬的半體內(nèi)殺菌曲線可以看出有相似的殺菌效果，在12 h時也有一定的殺菌活性，其他相似。
　　結(jié)合半體內(nèi)的藥效學(xué)和體外的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，和查閱的相關(guān)文獻，確定描述乙酰吉他霉素對豬鏈球菌作用特點的PK-PD參數(shù)為AUC/MIC。
　　2.乙酰吉他霉素及其單組份在豬體內(nèi)的藥動學(xué)研究
　　試驗選用12頭20 kg左右的斷奶仔豬，隨機分為兩組，分別為健康組和患病組，每組六只，采用皮下注射的方法構(gòu)建患

8、病模型，同時建立健康模型作為對照試驗組。兩組動物按50 mg/kg b.w.灌胃給藥后，通過豬的前腔靜脈在0.25 h、0.5 h、0.75 h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h采血，樣品處理后經(jīng)LC-MS/MS檢測不同時間點的藥物濃度，結(jié)果顯示血漿中乙酰吉他霉素的各個時間點濃度較低，且濃度在MIC以下，不能表現(xiàn)出細(xì)菌與藥物之間的相互作用；通過電子支纖維鏡在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h

9、、36h、48h、72h、96h進行采樣，樣品處理后經(jīng)LC-MS/MS檢測，經(jīng)過Winnonlin藥動學(xué)軟件對其進行擬合，乙酰吉他霉素及其單組分在患病和健康模型中均符合一級吸收二室模型。單組分乙酰 A6A7在肺部的達峰時間Tmax為4.38-4.54 h、達峰濃度Cmax為1.68-1.71μg/mL、消除半衰期T1/210為5.24-8.19 h、藥時曲線下面積AUC為9.59-20.55 h·μg/mL；乙酰A5′在肺部的達峰時間T

10、max為3.80-4.01 h、達峰濃度Cmax為3.34-3.47μg/mL、消除半衰期T1/210為6.57-6.70 h、藥時曲線下面積AUC為79.56-80.39 h·μg/mL；乙酰A4A5在肺部的達峰時間Tmax為3.91-4.40 h、達峰濃度Cmax為3.56-3.68μg/mL、消除半衰期T1/210為8.35-9.41 h、藥時曲線下面積AUC為112.02-118.41 h·μg/mL；乙酰A1A3在肺部的達峰時

11、間Tmax為3.91-4.72 h、達峰濃度Cmax為0.98-1.02μg/mL、消除半衰期T1/210為4.93-5.04 h、藥時曲線下面積AUC為19.24-19.96 h·μg/mL；乙酰A13在肺部的達峰時間Tmax為3.74-4.21 h、達峰濃度Cmax為0.81-0.82μg/mL、消除半衰期T1/210為5.97~6.67 h、藥時曲線下面積AUC為16.88-18.88 h·μg/mL；乙酰吉他霉素總組份在肺部的達

12、峰時間Tmax為4.26-4.44 h、達峰濃度Cmax為2.79-2.81μg/mL，消除半衰期T1/210為6.12-6.43 h，藥時曲線下面積AUC為61.78-63.46 h·μg/mL。
　　3.半體內(nèi)PK-PD模型的擬合與給藥方案制定
　　通過體外和半體內(nèi)殺菌曲線確定了描述乙酰吉他霉素殺菌作用特點的PK-PD參數(shù)為半體內(nèi)AUC/MIC。再通過Sigmoid Emax方程模擬半體內(nèi)AUC/MIC值與肺部不同藥物濃

13、度和豬鏈球菌的數(shù)目減少之間的關(guān)系，患病豬的半體內(nèi) PK-PD方程為：，當(dāng)E=0、-3、-4(抑菌、殺菌、根除)時，求出對應(yīng)的C值，即半體內(nèi)AUC/MIC(h)值分別為17.31、43.37、96.81。結(jié)合給藥方程與臨床分離目標(biāo)菌株的MIC值，可得不同條件下的給藥劑量 Dose(mg/kg/d)。當(dāng)臨床分離豬鏈球菌的MIC50為1μg/mL，AUC/MIC(h)值分別為17.31、43.37、96.81時，對應(yīng)乙酰吉他霉素的給藥劑量為1

14、5.62 mg/kg/d、39.14 mg/kg/d、87.36 mg/kg/d(抑菌、殺菌、根除)。
　　在體外殺菌曲線和半體殺菌曲線的結(jié)果中可以看到，在給藥后1h采的樣，隨著時間的延長濃度高于2 MIC時乙酰吉他霉素抑菌作用明顯，2 h~12 h隨著濃度的增加，抑菌作用也明顯增加，在2 MIC濃度以下的豬鏈球菌恢復(fù)生長較快。結(jié)合T>MIC(16.7 h)、T>MPC(10.13 h)和抗菌后效應(yīng)PAE=2.96 h，并通過軟件

15、MlxPlore模擬在確定的給藥劑量下的給藥時間間隔。若是每天給藥一次，大部分時間藥物濃度在1 MIC左右，在所測得的耐藥突變窗范圍之內(nèi)，容易引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗，同時通過耐藥風(fēng)險評估可以看出在12 h之后容易出現(xiàn)耐藥菌株；若是濃度在耐藥突變窗(5μg/mL)以上就會避免這種情況。因此，綜合考慮乙酰吉他霉素的抗菌后效應(yīng)，縮短給藥時間間隔，每天給藥兩次，藥物濃度在12 h內(nèi)就會在耐藥突變窗以上，理論上不會產(chǎn)生耐藥豬鏈球菌。根據(jù)

16、測得耐藥風(fēng)險評估結(jié)果，也不推薦每天一次給藥。按治療劑量每天給藥兩次可避免耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生。所以，對于豬鏈球菌引起的呼吸道疾病病的預(yù)防給藥方案為15.62 mg/kg；治療給藥方案為39.14 mg/kg；根除方案為87.36 mg/kg。
　　考慮到現(xiàn)現(xiàn)代化的養(yǎng)殖方式，口服給藥繁瑣，根據(jù)群體給藥公式D=d×n/W，n表示每天給要得次數(shù)，d表示按體重給藥量，W為不同年齡段豬體重與采食量的轉(zhuǎn)化比，20 kg左右的豬的W值約為50 g/k

17、g/d，D為群體混飼給藥量，由此而計算得到混飼給藥量是1.56 g/kg飼喂給藥，每天兩次。
　　4.模型驗證
　　選用MIC值為1μg/mL的臨床分離豬鏈球菌1607對仔豬進行攻毒，根據(jù)PK-PD模型制定的防耐藥給藥方案：39.14 mg/kg每天兩次口服給藥治療，結(jié)果表明該給藥方案對發(fā)病的仔豬保護率達到66.7％且減少了耐藥豬鏈球菌的產(chǎn)生。
　　綜上所述，本課題中闡述了乙酰吉他霉素對豬鏈球菌的抗菌作用特點，描述了乙