大鼠視網(wǎng)膜干細胞生物學和電生理學特性研究.pdf

1、視網(wǎng)膜退行性變疾病是嚴重的致盲眼病，對于這類疾病目前尚缺乏有效阻止病變進展和恢復視網(wǎng)膜功能的治療方法。視網(wǎng)膜干細胞移植是新發(fā)展起來并具有廣闊應用前景的治療戰(zhàn)略，其中關鍵性步驟是提供功能良好的視網(wǎng)膜干細胞。 就視網(wǎng)膜干細胞的功能研究方面，目前有許多研究者從形態(tài)學及神經(jīng)化學角度證實了視網(wǎng)膜干細胞增殖和分化特性，但是有關視網(wǎng)膜干細胞電生理學特性的研究，目前僅有關于早期和晚期視網(wǎng)膜干細胞電生理學特性研究的比較，而關于從視網(wǎng)膜干細胞到其分

2、化成成熟神經(jīng)元的過程缺乏系統(tǒng)的電生理學研究。采用分子生物學手段雖然能夠了解每個細胞基因的位置和機能，但是并不能徹底研究神經(jīng)元的電生理特性。眾所周知，神經(jīng)元的基本功能是信號傳遞，離子和離子通道是產(chǎn)生生物電信號的基礎，也是細胞興奮產(chǎn)生動作電位的基礎。電信號在細胞內(nèi)整合信息，動作電位沿軸突快速傳遞到末梢，形成生物體細胞間信息傳遞及神經(jīng)元回路構建，因此研究視網(wǎng)膜干細胞不同分化階段神經(jīng)元樣細胞的離子通道特點，對了解這些視網(wǎng)膜干細胞分化后的細胞能否

3、具備神經(jīng)元的基本功能具有非常重要的意義。膜片鉗技術是一種以記錄離子通道的電流來反映細胞膜上單一的(或多個的)離子通道分子活動的新技術，從細胞水平觀察離子通道機能，且在同一細胞上可觀察不同通道的活動。因此對視網(wǎng)膜干細胞的研究如果僅采用分子生物學手段將具有一定局限性，若能將膜片鉗技術與形態(tài)學、分子生物學等方法相結(jié)合，將有利于將視網(wǎng)膜干細胞的生物學特性和電生理特性結(jié)合起來，為研究視網(wǎng)膜干細胞提供強有力的理論依據(jù)。 同時對視網(wǎng)膜干細胞向

4、特異性視網(wǎng)膜細胞分化能力的研究，也是提供功能良好的視網(wǎng)膜干細胞的關鍵之一。另外，就視網(wǎng)膜色素變性疾病發(fā)展過程中是否存在內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細胞進行初步探討，為尋求挽救視網(wǎng)膜色素變性患者的視功能新的治療途徑提供實驗依據(jù)。 本研究通過分離和培養(yǎng)胚胎大鼠視網(wǎng)膜干細胞，初步探討特定發(fā)育階段的視網(wǎng)膜外液微環(huán)境對視網(wǎng)膜干細胞分化的影響，分析視網(wǎng)膜干細胞不同分化階段細胞電壓門控離子通道的表達特點及其變化趨勢，了解視網(wǎng)膜干細胞不同分化階段細胞的電生理

5、學特性，以期探索視網(wǎng)膜干細胞功能分化的物質(zhì)基礎。并就視網(wǎng)膜色素變性疾病發(fā)展過程中是否存在內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細胞進行了初步研究。 本研究在上述這些方面做了大量的工作，具體在以下四方面進行研究： 第一部分：視網(wǎng)膜干細胞的培養(yǎng)及凍存 LongEvans胚胎17天大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮來源的視網(wǎng)膜干細胞培養(yǎng)、傳代、凍存、復蘇，并對復蘇后的細胞進行生物學檢測和能否進一步分裂增殖、分化的鑒定，為下面的研究工作做準備。 本研究

6、成功建立了培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜干細胞的方法，獲得了可自我擴增傳代、性狀穩(wěn)定的視網(wǎng)膜干細胞，在血清誘導分化條件下可分化為多種表達視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性標志物的細胞。掌握了視網(wǎng)膜干細胞有效凍存和復蘇的實驗方法，復蘇后視網(wǎng)膜干細胞的存活率約為60-70％，細胞性狀穩(wěn)定不發(fā)生分化，仍具有自我增殖能力，且可以用血清誘導分化為不同的視網(wǎng)膜細胞。不同的凍存時間對其存活率沒有影響。 第二部分：細胞外液微環(huán)境對視網(wǎng)膜干細胞影響的研究

7、 1、新生鼠視網(wǎng)膜細胞外液微環(huán)境對視網(wǎng)膜干細胞特異性誘導分化的影響本部分通過Transwell共培養(yǎng)裝置分層培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜干細胞和新生鼠視網(wǎng)膜混合細胞，同時以成年階段(30天齡大鼠)的視網(wǎng)膜混合細胞為對照，觀察視網(wǎng)膜干細胞的分化比率變化。由于二者細胞外液相通，但細胞不發(fā)生接觸，這樣可以模擬新生和成年時段時的視網(wǎng)膜外液微環(huán)境，研究它們對視網(wǎng)膜干細胞誘導分化的影響。 2、視網(wǎng)膜變性鼠視網(wǎng)膜細胞外液微環(huán)境對視網(wǎng)膜干細胞的影響將RSC

8、s在Transwell系統(tǒng)中，與RCS大鼠視網(wǎng)膜共培養(yǎng)，在掃描電鏡下觀察變性視網(wǎng)膜組織分泌物對視網(wǎng)膜干細胞遷移、分化的影響。 新生大鼠視網(wǎng)膜混合細胞可能分泌某種物質(zhì)，可以提高視網(wǎng)膜干細胞向光感受細胞的分化比率，而成熟大鼠視網(wǎng)膜混合細胞不具備此功能，可能與該階段細胞分化信號途徑的關閉有關系；變性視網(wǎng)膜上清液微環(huán)境對共培養(yǎng)的干細胞具有趨向誘導作用，并能誘導視網(wǎng)膜干細胞進一步分化，干細胞受到周圍組織細胞及細胞外基質(zhì)的作用和影響可趨向運

9、動并誘導分化。 第三部分：視網(wǎng)膜干細胞不同分化階段細胞電生理學特性檢測 培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜干細胞，運用全細胞膜片鉗技術(Whole-cellPatchClamp)分析視網(wǎng)膜干細胞不同分化階段細胞電壓門控離子通道的表達特點及其變化趨勢，系統(tǒng)和深入地研究大鼠視網(wǎng)膜干細胞分化不同階段的電生理學特性，以期探索視網(wǎng)膜干細胞功能分化的物質(zhì)基礎。同時將新生鼠視網(wǎng)膜混合細胞外液誘導視網(wǎng)膜干細胞分化與10％胎牛血清非特異性誘導分化的細胞進行了

10、電生理學特性方面的比較研究。在對視網(wǎng)膜干細胞分化不同階段的細胞行膜片鉗全細胞記錄的同時，對不同階段的分化的部分細胞進行細胞內(nèi)熒光黃(LuciferYellow，LY)標記，觀察視網(wǎng)膜干細胞分化不同階段的細胞的形態(tài)學特性，并將其與分離培養(yǎng)的相應時間段的視網(wǎng)膜神經(jīng)元進行比較。目的在于為視網(wǎng)膜干細胞進一步應用于細胞替代治療視網(wǎng)膜變性疾病提供功能水平上的理論依據(jù)。 本研究應用全細胞膜片鉗法成功記錄視網(wǎng)膜干細胞分化不同階段細胞上表達的多種

11、不同電壓門控離子通道，證實了用全細胞膜片鉗法進行干細胞分化后離子通道細胞功能檢測分析的可行性。采用細胞內(nèi)注射技術，能清晰地顯示在普通顯微鏡下不能很好觀察的細胞形態(tài)，對于干細胞的形態(tài)特性及功能分析提供了很好的研究手段。 1、干細胞分化過程中逐漸發(fā)育出電壓門控性離子通道，這些通道支持短時程、反復性動作電位的發(fā)放；視網(wǎng)膜干細胞與其不同分化階段神經(jīng)樣細胞擁有不同的電壓門控性電流，從細胞功能的水平闡述了該視網(wǎng)膜干細胞及其分化細胞的標志，為

12、今后視網(wǎng)膜干細胞移植從功能角度提供了理論依據(jù)。 2、大鼠視網(wǎng)膜干細胞分化過程中逐漸發(fā)育出電壓門控性離子通道，推測離子通道的發(fā)育是神經(jīng)元分化過程中的重要環(huán)節(jié)，這些通道進一步分化后可支持動作電位發(fā)放，表明離子通道的發(fā)育是視網(wǎng)膜干細胞分化成具有功能的成熟神經(jīng)元的有效標志，為今后視網(wǎng)膜干細胞研究從功能角度提供了理論依據(jù)。 3、所培養(yǎng)的視網(wǎng)膜干細胞能分化為功能性神經(jīng)元，可以發(fā)放動作電位。今后若能將特異性誘導分化與膜片鉗技術相結(jié)合，

13、對特異性誘導分化后的細胞進行功能檢測，對于探討誘導不同類型視網(wǎng)膜神經(jīng)元的調(diào)節(jié)機制有重要的作用。 4、細胞不同的電生理學特性與細胞不同的形態(tài)構筑有一定的相關性，但尚缺乏一套完整的對應機制，有待于深入研究，將功能與形態(tài)完美結(jié)合。 第四部分：視網(wǎng)膜色素變性疾病發(fā)展過程中內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細胞的鑒定 采用RCS大鼠作為先天遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病模型，初步觀察視網(wǎng)膜色素變性疾病過程中內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細胞的存在、定位，為尋求挽救

14、視網(wǎng)膜色素變性患者的視功能新的治療途徑提供實驗依據(jù)。 本研究指出，RCS大鼠不同發(fā)育階段均發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細胞的存在，遺傳性視網(wǎng)膜色素變性可能作為一種慢性刺激因素激活了自身內(nèi)部潛在的視網(wǎng)膜干細胞。 本研究取得的主要結(jié)論如下： 1、大鼠視網(wǎng)膜干細胞的凍存復蘇并不影響其原有的增殖及分化特性，有利于為今后建立“人視網(wǎng)膜干細胞庫”提供方法學基礎。 2、新生大鼠視網(wǎng)膜混合細胞可能分泌某種物質(zhì)，可以提高視網(wǎng)膜干細胞

15、向光感受細胞的分化比率，而成熟大鼠視網(wǎng)膜混合細胞不具備此功能，可能與特定階段視網(wǎng)膜細胞外液微環(huán)境中分化信號的不同有關系。 3、應用全細胞膜片鉗法成功記錄視網(wǎng)膜干細胞分化不同階段細胞上表達的多種不同電壓門控離子通道，證實了用全細胞膜片鉗法進行干細胞分化后離子通道細胞功能檢測分析的可行性。采用細胞內(nèi)注射技術，能清晰地顯示在普通顯微鏡下不能很好觀察的細胞形態(tài)。這將不僅有利于今后采用膜片鉗技術進一步深入研究視網(wǎng)膜干細胞電生理學特性，而且

16、對干細胞的形態(tài)特性及功能分析的結(jié)合研究提供了很好的研究手段。 4、干細胞分化過程中逐漸發(fā)育出電壓門控性離子通道，這些通道支持短時程、反復性動作電位的發(fā)放；視網(wǎng)膜干細胞與其不同分化階段神經(jīng)樣細胞擁有不同的電壓門控性電流，闡述了視網(wǎng)膜干細胞及其分化細胞在細胞功能水平的標志，為今后視網(wǎng)膜干細胞移植從功能角度提供了理論依據(jù)。 5、大鼠視網(wǎng)膜干細胞分化過程中逐漸發(fā)育出電壓門控性離子通道，離子通道出現(xiàn)的先后順序是鉀通道先表達，鈉通道

17、后表達。鈉電流表現(xiàn)為從無到有，電流峰值即使在同一分化時間也大小不一。推測離子通道的發(fā)育是神經(jīng)元分化過程中的重要環(huán)節(jié)，為今后視網(wǎng)膜干細胞研究從功能角度提供了理論依據(jù)。 6、細胞膜的動作電位與鈉通道的開放有關。視網(wǎng)膜干細胞分化過程中，當鈉通道逐漸發(fā)育成熟產(chǎn)生鈉離子電流后，進一步分化方可成為可以發(fā)放動作電位的功能性神經(jīng)元，表明離子通道的發(fā)育是視網(wǎng)膜干細胞分化成具有功能的成熟神經(jīng)元的有效標志。 7、本研究對視網(wǎng)膜干細胞不同分化階