耐伊曲康唑申克孢子絲菌體外藥敏和分子生物學(xué)特性研究.pdf

1、孢子絲菌病是流行于熱帶及亞熱帶地區(qū)由申克孢子絲菌引起的皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統(tǒng)的亞急性和慢性感染,可累及臟器,具有一定致殘、致死率。根據(jù)《美國(guó)傳染病協(xié)會(huì)2007版申克孢子絲菌病臨床治療指南》推薦,伊曲康唑?yàn)榉窍到y(tǒng)性孢子絲菌病的首選單獨(dú)治療藥物。我們?cè)谂R床上發(fā)現(xiàn)3例對(duì)伊曲康唑治療不敏感的皮膚型孢子絲菌病患者,從中首次分離出4株申克孢子絲菌臨床耐藥株,但申克孢子絲菌的耐藥研究還是空白。本研究通過(guò)對(duì)這4株耐藥株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、雙相型轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

2、、掃描電鏡、ITS序列、體外單藥藥敏和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)研究,同時(shí)采用RAPD技術(shù)進(jìn)行臨床耐藥株和敏感株的基因型差異分析,探討申克孢子絲菌耐藥株和敏感株在表型、基因型和藥物敏感性等方面的差異；同時(shí)獲取了其編碼細(xì)胞色素P-450羊毛固醇14-α-脫甲基酶的耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因的表達(dá)序列片段,為分子耐藥機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.明確耐伊曲康唑申克孢子絲菌臨床株的形態(tài)學(xué)表型、基因型和體外藥敏的特性;
　　

3、 2.探討申克孢子絲菌臨床耐藥株和敏感株的基因型差異,獲取其耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因的表達(dá)序列片段,為分子耐藥機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.通過(guò)真菌鏡檢、培養(yǎng)、小培養(yǎng)、雙相轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和掃描電鏡技術(shù)對(duì)所分離臨床耐藥株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；
　　 2.采用真菌通用引物ITS4、ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增申克孢子絲菌臨床耐藥株的rDNA ITS區(qū)序列,產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；
　　 3.應(yīng)用M

4、38-A方案和改良M27-A2藥敏試驗(yàn)方案對(duì)申克孢子絲菌臨床耐藥株進(jìn)行菌絲相和酵母相的體外藥敏試驗(yàn)?；罨?分別制備菌絲相和酵母相菌懸液,菌絲相濃度調(diào)整至5×104CFU/ml(2倍終濃度),酵母相調(diào)整至2.5×103CFU/ml(2倍終濃度)；采用微量液基稀釋法加樣制板后,菌絲相置26℃,酵母相置35℃孵育,第5d觀察結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為各藥的MIC終點(diǎn)為100％生長(zhǎng)抑制,聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)采用分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)評(píng)價(jià)；
　　 4

5、.采用OPBG14和OPBG19兩條引物進(jìn)行RAPD,PCR擴(kuò)增4株臨床耐藥株及46株臨床非耐藥株及1株標(biāo)準(zhǔn)株。對(duì)擴(kuò)增的RAPD帶型進(jìn)行分析采用BioNumerics v.4.61軟件統(tǒng)計(jì)出各菌株的歐式遺傳距離,并按照Ward's algorithm with Jaccad's coefficient法進(jìn)行聚類分析,繪出親緣關(guān)系樹狀圖。
　　 5.提取申克孢子絲菌總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后采用針對(duì)耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因——編碼細(xì)胞色素

6、P-450羊毛固醇14-α-脫甲基酶基因片段的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　 結(jié)果:
　　 1.4株耐伊曲康唑申克孢子絲菌臨床株經(jīng)真菌培養(yǎng)、小培養(yǎng)、雙相轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和掃描電鏡技術(shù)鑒定符合申克孢子絲菌的真菌學(xué)特征；
　　 2.臨床耐藥株均能擴(kuò)增出400～600bp左右的rDNA ITS區(qū)域片段,所有片段的測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì),與申克孢子絲菌的模式菌株具有99％～100％同源性；
　　 3.臨床耐藥株在酵母相的伊曲康唑

7、單藥藥敏結(jié)果顯示較高的MIC值,均達(dá)到2μg/ml。臨床耐藥株與敏感株兩組在酵母相的伊曲康唑單藥藥敏MIC值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.02),而菌絲相則無(wú)差異(P=0.119>0.05)；兩組的特比萘芬單藥藥敏結(jié)果無(wú)論酵母相和菌絲相均無(wú)差異；
　　 4.聯(lián)合藥敏MIC值均明顯低于單藥藥敏MIC值。兩藥聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示在菌絲相耐藥株和非耐藥株均無(wú)相關(guān)作用,在酵母相中有2株菌的FICI結(jié)果顯示聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用,其余則表現(xiàn)為無(wú)相關(guān)

8、作用和拮抗作用。其中臨床耐藥株SUMS0382在酵母相的伊曲康唑和特比萘芬聯(lián)合藥敏FICI為0.375,顯示了兩種藥物的協(xié)同作用并與臨床療效一致。
　　 5.采用BioNumerics v.4.61軟件應(yīng)用Jaccard和Dice方法對(duì)OPBG14和OPBG19引物擴(kuò)增的所有申克孢子絲菌菌株的RAPD帶型進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示國(guó)內(nèi)不同地區(qū)來(lái)源的申克孢子絲菌基因帶型呈現(xiàn)多樣性,臨床耐藥株與敏感株在RAPD帶型及分組上未發(fā)現(xiàn)明顯聚類

9、現(xiàn)象；不同臨床類型及不同部位分離的申克孢子絲菌其帶型及分組無(wú)明顯的聚類現(xiàn)象；
　　 6.通過(guò)PCR方法采用所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增獲得與耐唑類藥物基因相關(guān)的申克孢子絲菌編碼細(xì)胞色素P-450羊毛固醇14α-脫甲基酶的基因序列片段,與白念珠菌ERG11基因的序列片段比對(duì)結(jié)果顯示具有高度一致的同源性。
　　 結(jié)論:
　　 1.從伊曲康唑治療失敗的孢子絲菌病患者皮損中分離的4株臨床耐藥株經(jīng)真菌形態(tài)學(xué)特征、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、電鏡和rDN

10、A ITS序列分析鑒定為申克孢子絲菌；
　　 2.采用M38-A方案和改良M27-A2藥敏試驗(yàn)方案進(jìn)行的申克孢子絲菌菌絲相和酵母相體外單藥藥敏和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中臨床耐藥株在致病相酵母相對(duì)伊曲康唑高M(jìn)IC結(jié)果證明其耐藥性；
　　 3.申克孢子絲菌耐藥株的伊曲康唑和特比萘芬體外藥敏試驗(yàn)的聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示具有協(xié)同作用且與相對(duì)應(yīng)的臨床療效一致,體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)指導(dǎo)聯(lián)合治療具有一定臨床意義；
　　 4.國(guó)內(nèi)不同地區(qū)來(lái)源