USP18在干擾素-α治療慢性乙肝過程中的預測意義及作用機制.pdf

1、目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染已經(jīng)成為全球公共健康問題，每年約有100萬人死于HBV感染相關的肝臟疾病?；顒有訦BV復制是導致肝臟損傷和疾病進展的關鍵因素，因此最大限度地長期抑制或清除HBV成為慢性乙型肝炎治療的總體目標。目前用于慢性乙型肝炎抗病毒治療的藥物主要有兩大類:1、核苷（酸）類似物;2、干擾素(interferon，IFN)。干擾素具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用，治療療程短而確定、耐藥少見，故逐漸成為臨床治療慢性乙型肝炎的主要

2、選擇。然而，目前干擾素治療只能達到30％-40％的HBeAg血清學轉換，約有60％的患者盡管接受干擾素抗病毒治療，但仍然遭受乙肝病毒的侵害，因此短期內(nèi)預測干擾素治療療效顯得尤為重要，最新研究熱點是干擾素抗病毒作用信號通路中的干擾素刺激基因，泛素特異性蛋白酶18(Ubiquitin-specificprotease18，USP18)是其中重要的一個干擾素刺激基因。本研究旨在探討USP18在干擾素-α治療慢乙肝過程中的預測意義及作用機制。<

3、br>　　 方法:選取慢性HBV感染者70例，均為免疫清除期患者，所有患者均進行肝組織活檢，無明顯干擾素抗病毒治療禁忌癥。留取受試者治療前新鮮外周血提取PBMCs進行體外干擾素-α孵育刺激試驗，并對受試者應用干擾素-α抗病毒治療，進行隨訪觀察24周，其中無病毒學應答患者(nonvirologicalresponse，NVR)18例，完全病毒學應答患者(completevirologicalresponse，CVR)32例，部分病毒學應

4、答患者(partialvirologicalresponse，PVR)20例，健康對照10例。
　　 1、體外干擾素-α孵育PBMCs:留取70例受試者治療前新鮮外周靜脈血，密度梯度離心法分離PBMCs，無血清培養(yǎng)基懸浮沉淀細胞，分為兩組:第一組空白對照組（不加任何因子）;第二組加入干擾素-α因子刺激孵育PBMCs，4h后收集細胞。
　　 2、對所有受試者應用干擾素-α抗病毒治療隨訪觀察，留取治療0周、1周、12周、24

5、周時新鮮外周血，密度梯度離心法分離收集PBMCs。
　　 3、Trizol法抽提外周血單個核細胞總RNA，應用Real-timePCR法檢測USP18、STAT1mRNA的表達水平。
　　 4、RIPA法提取細胞總蛋白應用westernblot法檢測USP18、STAT1、P-STAT1蛋白的表達水平。
　　 結果:
　　 1、健康對照組外周血PBMCs中USP18的表達為陰性
　　 2、干擾素-

6、α治療過程外周血PBMCs中USP18mRNA水平變化
　　 70例CHB患者在干擾素-α治療過程中接受mRNA水平檢測，將PBMCs中內(nèi)參GAPDH相對表達量設定為1.00，與GAPDH表達量相比較，干擾素-α治療前NVR組PBMCs中USP18的表達水平(0.073±0.026)較CVR組(0.043±0.023)及PVR組(0.044±0.022)高，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.665，P＜0.01）;治療1周時，各組PB

7、MCs中USP18的表達水平明顯升高，NVR組(0.098±0.023)、CVR組(0.071±0.027)、PVR組(0.074±0.027)，NVR組表達水平最高，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.781，P=0.002）;治療12周及24周時，各組表達水平為NVR組(0.097±0.024)(0.096±0.023)、CVR組(0.069±0.025)(0.066±0.025)、PVR組(0.075±0.026)(0.074±0.025)

8、，NVR組表達水平仍最高，差異有統(tǒng)計學意義(F1=7.140，p=0.002;F2=8.654,P＜0.01)。
　　 3、干擾素-α治療過程外周血PBMCs中USP18蛋白水平變化
　　 將PBMCs中內(nèi)參β-actin相對表達量設定為1.00，與β-actin表達量相比較，干擾素-僅治療前NVR組外周血PBMCs中USP18的表達水平(0.308±0.046)較CVR組(0.250±0.044)及PVR組(0.248

9、±0.048)高，差異有統(tǒng)計學意義(F=11.151，P＜0.01);治療1周后，各組USP18的表達水平明顯升高，NVR組(0.563±0.050)、CVR組(0.431±0.047)、PVR組(0.428±0.047)，NVR組表達水平最高，差異有統(tǒng)計學意義(F=51.722，P＜0.01);治療12周及24周時，各組表達水平為NVR組(0.568±0.051)(0.566±0.049)、CVR組(0.430±0.047)(0.42

10、9±0.045)、PVR組(0.426±0.047)(0.430±0.049)，NVR組表達水平仍最高，差異有統(tǒng)計學意義(F1=55.958，P＜0.01;F2=55.841,P＜0.01)。
　　 4、體外干擾素-α孵育刺激PBMCs后形態(tài)學觀察
　　 PBMCs經(jīng)2h貼壁后，可見部分細胞懸浮，多數(shù)細胞為B細胞和外周血DC，干擾素-α孵育刺激4h后未見形態(tài)學變化，細胞數(shù)目無明顯變化。
　　 5、體外干擾素-α刺

11、激PBMCs后USP18、STAT-1Mrna/蛋白水平變化
　　 體外干擾素-α刺激治療前外周血PBMCs后，干擾素-α組PBMCs中USP18在mRNA/蛋白上的表達水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而NVR組、CVR組及PVR組外周血PBMCs中STAT-1mRNA及其蛋白水平無顯著性差異。
　　 6、體外干擾素-僅刺激PBMCs后USP18表達水平與P-STAT-1表達水平的相關性
　　

12、 空白對照組及干擾素-α組PBMCs中P-STAT-1表達水平分別為:NVR組（0.25±0.02）、（0.58±0.05），CVR組（0.26±0.02）、（0.66±0.05），PVR組（0.26±0.01）、（0.65±0.05），干擾素-α組PBMCs中P-STAT-1表達水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，回歸分析結果顯示:干擾素-α刺激后PBMCs中USP18的表達水平與P-STAT-1的表達水平成負相關

13、性，相關系數(shù)為:-0.753(P＜0.01)。
　　 7、多種影響因素與干擾素-α治療療效的回歸分析
　　 將受試者的年齡、治療前HBV-DNA基線水平、肝組織炎癥分級、治療前ALT水平、及治療前PBMCs中USP18的表達水平多種因素與干擾素-α治療療效進行l(wèi)ogisitic回歸分析，通過逐步排除法，病毒載量、肝組織炎癥分級及治療前PBMCs中USP18的表達水平進入回歸方程，y=0.588+20.552x1-39.2

14、99x2+19.641x3，回歸方程有統(tǒng)計學意義(x2=35.682，P＜0.01)。
　　 結論:
　　 1、USP18的表達受干擾素刺激機體強烈誘導。
　　 2、USP18通過干擾STAT1的磷酸化作用，抑制干擾素-α抗病毒信號通路。
　　 3、HBV-DNA基線水平、肝臟炎癥分級及治療前PBMCs中USP18表達水平與干擾素-α治療療效均存在相關性，受試者治療前PBMCs中高水平表達USP18影響干