USP18-SOCS1在丙肝病毒耐受Ⅰ型和Ⅲ型干擾素中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　全球約1.5億人感染HCV，并且部分患者會(huì)發(fā)展成慢性感染進(jìn)而引發(fā)肝硬化及肝癌等疾病，嚴(yán)重危害人類健康。目前，長效干擾素聯(lián)合利巴韋林是治療慢性丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。但是，由于IFN-α受體在體內(nèi)廣泛分布而引發(fā)一系列不良反應(yīng)，加之耐藥性的存在，嚴(yán)重阻礙了它的臨床應(yīng)用。新的IFN家族——Ⅲ型干擾素(IFN-λ)，具有有限的受體分布且相同的抗病毒作用，成為替代IFN-α用于臨床治療HCV慢性感染者的新希望。
　　干擾素

2、刺激基因是IFN信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮抗病毒作用的終極武器，但是同時(shí)也是一把雙刃劍。ISG中存在一類負(fù)調(diào)控因子（包括USP18和SOCS1），他們阻斷干擾素信號(hào)通路的傳導(dǎo)形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)，這也是造成HCV對IFN治療耐受的原因之一。USP18(Ubiquitin specific protease18)是一種泛素特異性蛋白，它可以通過與IFNAR2受體結(jié)合阻斷Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的傳導(dǎo)，而對于Ⅲ型干擾素信號(hào)通路的影響還是個(gè)未知數(shù)。同時(shí)，細(xì)胞因子

3、信號(hào)傳導(dǎo)抑制分子1(Suppressor of cytokinesignaling1，SOCS1)作為干擾素內(nèi)源性抑制物，可以與Tyk2相互作用從而阻斷干擾素信號(hào)通路，抑制干擾素抗病毒活性導(dǎo)致HCV持續(xù)感染。而SOCS1在HCV的入胞和分泌過程中的作用還鮮有報(bào)道。
　　多項(xiàng)研究表明（包括本課題組前期研究），肝組織內(nèi)ISG差異表達(dá)與治療療效密切相關(guān)。此外，外周血單核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear ce

4、lls，PBMCs）有可能替代肝穿樣本用于療效預(yù)測的檢測?？紤]到目前干擾素治療HCV感染療效不理想及廣泛的不良反應(yīng)，揭示HCV耐藥的分子機(jī)制和建立高效的療效預(yù)測手段是HCV科研領(lǐng)域兩個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問題。本研究立足于探討負(fù)調(diào)控因子(USP18和SOCS1)在HCV耐受干擾素中的作用機(jī)制。
　　目的:
　　1、研究IFN-α和IFN-λ激活Jak/STAT及ISG表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)曲線的差異;
　　2、驗(yàn)證高表達(dá)USP18/

5、SOCS1對IFN-α和IFN-λ信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控和抗HCV活性的影響及在HCV病毒生活史中的作用（入胞、復(fù)制和分泌）;
　　3、探討慢性丙肝病人PBMC中相關(guān)基因的表達(dá)水平差異與治療療效的相關(guān)性。
　　方法:
　　1、將pCR3.1/SOCS1和pCR3.1/USP18真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Huh7.5.1細(xì)胞中，通過Realtime PCR和Western blot檢測目標(biāo)基因的表達(dá)情況從而優(yōu)化最適表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量，

6、轉(zhuǎn)染試劑使用量及IFN濃度。給予IFN-α和IFN-λ刺激后，不同時(shí)間點(diǎn)取樣，Realtime PCR測定ISG時(shí)間效應(yīng)曲線以及高表達(dá)USP18/SOCS1對于時(shí)間效應(yīng)曲線的影響。
　　2、將pCR3.1/USP18和pCR3.1/SOCS1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入復(fù)制子細(xì)胞Con1b、JFH1-2a及HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)、Realtime PCR和Western blot檢測高表達(dá)USP18/SOCS1對IFN

7、信號(hào)通路中P-STAT1磷酸化水平、ISRE活性及ISG表達(dá)水平的影響及HCV RNA復(fù)制水平的影響。在HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中高表達(dá)USP18/SOCS1，收集上清液，通過測定TCID50明確高表達(dá)USP18或SOCS1對HCV分泌的影響;提取胞內(nèi)RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過Realtime PCR檢測USP18或SOCS1高表達(dá)對HCV受體的調(diào)控及HCV RNA復(fù)制水平的影響從而確定其對HCV入胞的影響。
　　3、從48個(gè)治療后的HC

8、V慢性患者中提取PBMC，體外培養(yǎng)8h并同時(shí)給予IFN-α刺激，將未經(jīng)IFN-α刺激的體外培養(yǎng)PBMC作為陰性對照，通過Realtime PCR檢測相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化并確定其與治療療效的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1、使用最適轉(zhuǎn)染體系及最佳IFN工作濃度，我們確認(rèn)兩種干擾素(IFN-α/IFN-λ)誘導(dǎo)ISGs(ISG15/MxA)的時(shí)間效應(yīng)曲線具有明顯差異:IFN-α誘導(dǎo)下ISG表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)曲線峰值出現(xiàn)快且持續(xù)時(shí)間短，

9、而IFN-λ誘導(dǎo)下ISG表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)曲線峰值出現(xiàn)慢且持續(xù)時(shí)間長;而由這兩種干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控因子(USP18/SOCS1)表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)曲線正好與之相反。提示干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路中兩個(gè)主要的負(fù)調(diào)控因子SOCS1及USP18是導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅲ型干擾素激活Jak/STAT刺激ISG表達(dá)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)差異的主要原因。
　　2、高表達(dá)USP18/SOCS1在HCV復(fù)制子細(xì)胞(Con1b和JFH1-2a)中，可以通過下調(diào)P-STAT磷酸化水平

10、、減弱ISRE活性及降低ISG表達(dá)水平從而全面阻斷Ⅰ型干擾素和Ⅲ型干擾素信號(hào)通路。此外，在HCVcc體外培養(yǎng)系統(tǒng)中也表明，由它們所介導(dǎo)的這種對干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用顯著地促進(jìn)了HCV的復(fù)制水平，并且高表達(dá)USP18顯著上調(diào)了HCV受體LDLR和SR-BI的轉(zhuǎn)錄水平從而促進(jìn)了HCV病毒的入胞，而高表達(dá)SOCS1雖然顯著上調(diào)了HCV受體LDLR的轉(zhuǎn)錄水平但對 HCV病毒的入胞無影響。此外這兩種負(fù)調(diào)控因子對于HCV分泌均無影響。

11、　　3、本實(shí)驗(yàn)對PBMC中部分基因的表達(dá)變化與干擾素治療HCV療效相關(guān)性進(jìn)行了初步探討，我們明確了MxA、SOCS1、IFNAR1及IFNλR在干擾素治療無應(yīng)答組的本底水平高表達(dá)，而USP18和ISG15在治療有應(yīng)答與無應(yīng)答不同組中本底水平的表達(dá)無差異。
　　結(jié)論:
　　1、證明負(fù)調(diào)控因子(USP18/SOCS1)的表達(dá)差異是造成IFN-α和IFN-λ激活干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)抗病毒ISG(ISG15/MxA)時(shí)間效應(yīng)曲線差

12、異的主要原因，可能也是造成IFN耐受的原因之一。
　　2、高表達(dá)USP18/SOCS1可以阻斷Ⅰ型干擾素和Ⅲ型干擾素信號(hào)通路而顯著促進(jìn)HCV病毒復(fù)制，其中，高表達(dá)USP18可以上調(diào)HCV入胞受體水平而有利于病毒入胞。促進(jìn)HCV入胞、刺激HCV RNA復(fù)制及全面抑制干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路也許是HCV耐受干擾素導(dǎo)致治療失敗的重要原因。
　　3、明確HCV慢性患者PBMC中MxA、SOCS1、IFNAR1及IFNλR在本底水平的高表達(dá)