β-欖香烯對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549體外放射增敏作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、放射治療是根治惡性腫瘤的主要手段之一，臨床約有70%的惡性腫瘤需要放射治療，由于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及局部微環(huán)境等因素的影響往往致放射治療療效不盡如人意，因此，尋找有效的放射增敏劑具有重要意義。 一些放射增敏化合物，如米索硝唑（minsonidazole，MISO），雖然能特異性地增敏乏氧細(xì)胞，具有較好的增敏性，因其臨床嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，大大限制了臨床上的運(yùn)用。由于中草藥毒副作用小，中藥放療增敏劑日益受到重視。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)某些

2、中藥具有放射增敏效應(yīng)。欖香烯是從姜科植物溫郁金中提取的非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥，具有廣譜抗腫瘤作用，毒副作用小，能提高腫瘤放射增敏效應(yīng)。過(guò)去對(duì)欖香烯抗癌作用機(jī)制的研究?jī)H限于欖香烯對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影響，關(guān)于其作用靶點(diǎn)研究很少報(bào)道。 本研究選用低細(xì)胞毒性的β-欖香烯作用于肺腺癌A549細(xì)胞，觀察β-欖香烯對(duì)A549細(xì)胞體外放射增敏作用，初步探討放射增敏作用靶點(diǎn)，為β-欖香烯放射增敏劑臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3、目的：研究β-欖香烯對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株放射敏感性的影響，探討其放射敏感性與Ku70、Ku80mRNA表達(dá)的關(guān)系。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用人肺腺癌細(xì)胞株A549作為研究對(duì)象，β-欖香烯由大連金港制藥有限公司提供，細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組用含不同濃度（10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml、320ug/ml）β-欖香烯RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在不同照射劑量（2G

4、y、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy）下直線加速器6MV-X線照射，采用MTT法測(cè)定不同濃度β-欖香烯對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率；克隆形成率觀察β-欖香烯對(duì)A549細(xì)胞的放射增敏作用；RT-PCR法檢測(cè)單純?chǔ)?欖香烯（10ug/ml、20ug/ml）聯(lián)合放療后KU70及KU80mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1．β-欖香烯作用A549細(xì)胞24h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為120ug/ml。 2．β-欖香烯對(duì)A549細(xì)胞

5、有顯著抑制作用，隨著藥物濃度的增大，OD值逐漸減小，細(xì)胞的抑制率逐漸增高（p<0．05）。 3．20ug/mlβ-欖香烯作用24h后聯(lián)合不同劑量照射的A549細(xì)胞測(cè)OD值。單純放療（0Gy、2Gy、4Gy．6Gy、8Gy、10Gy）組其OD值分別為0．964±0．025、0．825±0．012、0．758±0．042、0．623±0．011、0．544±0．031、0．376±0．015，20ug/mlβ-欖香烯作用24小時(shí)后聯(lián)

6、合上述不同劑量照射的放療組OD值分別為0．828±0．009、0．650±0．022、0．562±0．016、0．474±0．011、0．345±0．015、0．205±0．014。結(jié)果提示：相同劑量下，20ug/mlβ-欖香烯聯(lián)合放療組OD值均較單純放療組降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間有顯著性差異（P<0．05）。初步判斷β-欖香烯對(duì)A549細(xì)胞有放射增敏作用。 4．10ug/ml和20ug/mlβ-欖香烯作用24小時(shí)后聯(lián)合不同劑量的細(xì)

7、胞克隆數(shù)及存活率的檢測(cè)，單純放療（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy）組克隆數(shù)分別為97±3．12、82±2．35、64±3．17、45±2．06、24±3．18、12±1．64，10ug/mlβ-欖香烯作用24小時(shí)后聯(lián)合上述照射劑量放療組細(xì)胞克隆數(shù)分別為92±3．23、73±2．51、55±3．84、36±4．08、17±3．21、7±1．63；20ug/mlβ-欖香烯作用24小時(shí)后聯(lián)合上述照射劑量放療組細(xì)胞克隆數(shù)分別為

8、88±3．09、65±4．25、42±3．87、28±1．67、12±1．59、4±1．10。結(jié)果提示：10ug/ml、20ug/mlβ-欖香烯作用24小時(shí)后聯(lián)合上述照射劑量放療組較單純放療組細(xì)胞克隆數(shù)明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組間有顯著性差異（P<0．05）；且10ug/ml、20ug/ml兩濃度組之間亦有顯著性差異（p<0．05）。因此，克隆形成率進(jìn)一步證明β-欖香烯在低細(xì)胞毒性濃度下對(duì)A549細(xì)胞有放射增敏作用，且隨藥物濃度逐漸增加，

9、放射增敏作用逐漸增強(qiáng)。 5．20ug/mlβ-欖香烯作用24h與48h后的細(xì)胞集落結(jié)果及存活率結(jié)果比較有顯著性差異（p<0．05）。單純照射（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy）后細(xì)胞克隆數(shù)分別為97±3．12、82±2．35、64±3．17、45±2．06、24±3．18、12±1．64；20ug/mlβ-欖香烯作用24h后聯(lián)合上述劑量放療組細(xì)胞克隆數(shù)分別為88±3．09、65±4．25、42±3．87、28±1

10、．67、12±1．59、4±1．10；20ug/mlβ-欖香烯作用48h后聯(lián)合上述劑量放療組細(xì)胞克隆數(shù)分別為76±2．15、47±3．42、30±2．37、17±1．80、5±1．09、0±0．0。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間有顯著性差異（P<0．05）。提示β-欖香烯在低細(xì)胞毒性濃度下對(duì)A549細(xì)胞有放射增敏作用，且隨作用時(shí)間增加，放射增敏作用增強(qiáng)。 6．Ku70與Ku80的表達(dá)：Ku80及Ku70的mRNA在10ug/ml與20ug/ml

11、聯(lián)合放療各組細(xì)胞中均有表達(dá)，與對(duì)照組比較，單純放療組表達(dá)略有增加，單純欖香烯組表達(dá)略有減少，兩者與對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)明顯差異（P>0．05）。β-欖香烯（10ug/ml、20ug/ml）聯(lián)合放療組Ku80及Ku70mRNA表達(dá)明顯低于單純放療組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間有顯著性差異（P<0．05）；20ug/mlβ-欖香烯聯(lián)合放療組表達(dá)低于10ug/mlβ-欖香烯組聯(lián)合放療組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間有顯著性差異（P<0．05）。提示β-欖香烯的放射

12、增敏作用可能通過(guò)下調(diào)KU80、KU70的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。 結(jié)論： 1．β-欖香烯對(duì)A549細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，IC50為120ug/ml，抑制率隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，且抑制作用有劑量依賴(lài)性。 2．β-欖香烯在低細(xì)胞毒性濃度下對(duì)A549細(xì)胞有放射增敏作用，并隨濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，放射增敏作用增強(qiáng)，其增敏作用有濃度及時(shí)間依賴(lài)性。 3．單純放療及單用β-欖香烯對(duì)A549細(xì)胞Ku70、Ku80的mRNA