水通道蛋白3、4、8在大鼠慢傳輸便秘模型結(jié)腸黏膜中的表達(dá).pdf

1、目的:
　　 便秘(constipation)是一種很常見的臨床癥狀，表現(xiàn)為排便次數(shù)少，或排便不暢、費(fèi)力、困難、糞便干結(jié)且很少，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。但是對(duì)便秘的診治還處于探索階段；2006年頒布的羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)[1]對(duì)便秘的診斷做了進(jìn)一步完善，對(duì)深入便秘的研究起了推動(dòng)作用。便秘是由多種致病因素引起的，包括胃腸道疾病，以及累及胃腸道的其他系統(tǒng)疾病，不少藥物也可引起便秘；其中在便秘中，功能性便秘(Functional consti

2、pation FC)疾病占大多數(shù)。同時(shí)可根據(jù)引起便秘的腸道動(dòng)力和（或）肛門直腸功能的檢查特點(diǎn)進(jìn)一步將功能性便秘分為：慢傳輸型便秘(Slow transit constipation，STC)、出口梗阻型便秘(Outlet obstructive constipation， OOC)和混合型便秘(MIX)[2-4]。其中慢傳輸型便秘(STC)就是一類以胃腸道動(dòng)力減弱，內(nèi)容物傳輸時(shí)間延長(zhǎng)為主要特點(diǎn)的頑固性便秘，臨床上主要表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、

3、無便意、排便困難、大便干燥等。有關(guān)STC的發(fā)病機(jī)制的研究表明，STC的發(fā)生是由多種因素造成的，其中包括腸道神經(jīng)、平滑肌的變性異常以及心理因素和遺傳因素等。在眾多研究中，國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道對(duì)STC中的和腸道水份吸收相關(guān)的水通道蛋白(Aquaporin AQP)的研究，在STC患者中，腸道內(nèi)容物水份被過度吸收，變得干涸，不利于內(nèi)容物向前推進(jìn)，進(jìn)而進(jìn)一步延長(zhǎng)了排便間隔時(shí)間，并排出干燥大便。在此過程中，AQPs是否發(fā)生改變，參與了STC的發(fā)生、發(fā)展

4、；對(duì)此研究還缺乏進(jìn)一步深入。AQPs是龐大的跨膜通道蛋白(major intrinsic protein，MIP)家族中的一種[5]。許多疾病的病理生理過程都與AQPs有關(guān)，包括白內(nèi)障、肺水腫、肝硬化、先兆性子癇等。那么通過對(duì)AQPs表達(dá)及功能的調(diào)控，對(duì)治療一些疾病提供了新的治療途徑。相關(guān)研究表明[6-8]AQP3、4、8等存在于結(jié)腸，與結(jié)腸水份的吸收關(guān)系緊密，但在STC患者表達(dá)情況尚不清楚，本研究通過制造大鼠慢傳輸便秘模型，利用RT-

5、PCR技術(shù)對(duì)STC組大鼠結(jié)腸黏膜上的AQP3、4、8的表達(dá)與分布情況進(jìn)行測(cè)量，進(jìn)而探討其與STC關(guān)系。
　　 材料和方法:
　　 取體重約150g的Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，雌雄各半，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：SCXK（豫）2005-0001。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=16)和實(shí)驗(yàn)組(n=16)．兩組體重、性別之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；所有大鼠均單籠飼養(yǎng)。購(gòu)得動(dòng)物后7天環(huán)境適應(yīng)

6、期，實(shí)驗(yàn)開始前5天，每天均按0.32ml/kgBW蒸餾水灌胃，以讓大鼠適應(yīng)灌胃過程，減少因腸應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響[9]實(shí)驗(yàn)開始后，對(duì)照組按0.32ml/kgBW蒸餾水灌胃，模型組按8mg/kgBW予復(fù)方地芬諾酯懸溶液(0.4ml/10mg)灌胃[10]。每5天測(cè)一次首粒黑便時(shí)間：測(cè)試前一天兩組大鼠禁食不禁水12小時(shí)，于次日測(cè)定前，模型組予以復(fù)方地芬諾酯懸溶液、對(duì)照組予以蒸餾水，30分鐘后灌以墨汁指示劑，然后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠正常進(jìn)食飲水，從

7、灌墨汁時(shí)始記錄每只動(dòng)物首粒黑便排出時(shí)間，并對(duì)兩組動(dòng)物排出時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析直至兩組時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，此時(shí)停藥7天后再測(cè)，兩組傳輸時(shí)間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，此時(shí)慢傳輸便秘模型建立。大鼠禁食不禁水12小時(shí)，3％戊巴比妥鈉麻醉后，由腹正中切口入腹，截取升降結(jié)腸并刮取其黏膜，置入液氮中凍存。AQP3、4、8的檢測(cè)方法：首先按照TRIZOL試劑盒的說明對(duì)保存的結(jié)腸黏膜進(jìn)行總RNA的提取，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試

8、劑盒的說明合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后，條帶在High Performance Ultraviolet Trans illuminator(UVP)凝膠成像系統(tǒng)上掃描，觀察擴(kuò)增后的條帶是否符合目的條帶，然后利用Image-Pro Plus軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值的測(cè)定，并取目的條帶與對(duì)應(yīng)的內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果:
　　 1．實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的升降結(jié)腸都有AQP3的表達(dá)

9、，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組升結(jié)腸AQP3灰度比值分別為0.344±0.212、0.602±0.239。兩組降結(jié)腸AQP3灰度比值分別為0.419±0.309、0.509±0.308。STC組升結(jié)腸AQP3的表達(dá)低于對(duì)照組升結(jié)腸(P＜0.05)，兩組之間的降結(jié)腸表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.兩組的升降結(jié)腸都有AQP4的表達(dá)，其中在STC組和對(duì)照組升結(jié)腸的表達(dá)分別是0.764±0.544、0.759±0.629。在兩組降結(jié)腸

10、的表達(dá)分別是0.776±0.642、0.736±0.424。在兩組的升結(jié)腸之間無明顯差異(P＞0.05)；在兩組之間的降結(jié)腸之間也無明顯差異。(P＞0.05)。
　　 3．AQP8在兩組升降結(jié)腸無明顯表達(dá)，或有少量表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1．AQP3在兩組的升降結(jié)腸都有表達(dá)，STC組升結(jié)腸表達(dá)下調(diào)，而其降結(jié)腸和對(duì)照組的降結(jié)腸黏膜相比無明顯變化；提示：AQP3參與結(jié)腸水份吸收起重要作用，且主要發(fā)生在升結(jié)腸，可能