氯胺-T法及Iodogen法碘標(biāo)記c-erbB-2反義寡脫氧核苷酸的對(duì)比研究.pdf

1、目的與研究背景：本課題采用氯胺一T法和Iodogen法兩種標(biāo)記方法進(jìn)行反義寡脫氧核苷酸的125I間接標(biāo)記對(duì)比研究，并在兩種方法中分別探討不同反應(yīng)條件下的標(biāo)記率及標(biāo)記產(chǎn)物的放化純、比活度和穩(wěn)定性。力求找到最合適的標(biāo)記方法、最恰當(dāng)?shù)臉?biāo)記條件。為今后碘標(biāo)記的反義藥物應(yīng)用于臨床奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 乳腺癌c-erbB2基因有條件激活和擴(kuò)增是乳腺癌的早期事件，胞漿中mRNA增加，使與目的mRNA互補(bǔ)的反義寡脫氧核苷酸(ASODN)識(shí)別及結(jié)合增加

2、。用放射性核素標(biāo)記ASODN，在體外顯像可以診斷體內(nèi)mRNA水平變化，腫瘤的存在和大小。因此可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的早期無創(chuàng)性診斷。 放射性核素標(biāo)記ASODN是反義顯像藥物合成的最關(guān)鍵步驟。標(biāo)記藥物制備不成功就無法進(jìn)行下一步的藥物體內(nèi)外分析，更談不上反義顯像和反義治療。因此，探索高效、便捷、穩(wěn)定的標(biāo)記方法，是將反義顯像和治療技術(shù)應(yīng)用于臨床的重要基礎(chǔ)。 方法： l、氯胺T法1251直接標(biāo)記乙酰雙半胱氨酸(EC)，證明其可行性

3、。 2、設(shè)計(jì)并合成c-erbB-2基因的部分硫代ASODN，序列為5'-CTCCATGGTGCTCAC-Y。 3、EC與ASODN連接，純化，冷凍干燥。瓊脂糖電泳鑒定其結(jié)構(gòu)。 4、按照正交設(shè)計(jì)表，改變反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、氯胺-T或Iodogen用量及反應(yīng)的PH值，以氯胺T法和Iodogen法分別進(jìn)行125I標(biāo)記EC-ASODN。測(cè)定標(biāo)記率和比活度，SephadexG-25柱層析純化收集，TLC測(cè)定標(biāo)記產(chǎn)物放化純，

4、探討最適宜的標(biāo)記條件。標(biāo)記產(chǎn)物放置一定時(shí)間后再次TLC測(cè)其穩(wěn)定性。 5、培養(yǎng)乳腺癌SK-Br-3細(xì)胞，MTT法對(duì)兩種標(biāo)記方法所得12~I-EC-ASODN分別進(jìn)行生物活性鑒定。顯微鏡下觀察125I-EC-ASODN干預(yù)后SK-Br-3細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化。 結(jié)果： 1、氯胺T法1251標(biāo)記EC成功。標(biāo)記率為72．17％。 2、瓊脂糖電泳證實(shí)EC與ASODN連接形成EC-ASODN。 3、氯胺T法12

5、5I標(biāo)記EC-ASODN，最佳反應(yīng)條件為，常溫下，氯胺T與ASODN投料比1：1，pH值7．4，反應(yīng)時(shí)間4分鐘。分離純化后TLC測(cè)得放化純>92％，比活度>23。 4、Iodogen法125I標(biāo)記EC-ASODN，最佳反應(yīng)條件為，45℃，Iodogen與ASODN投料比4：1，pH值7．4，反應(yīng)時(shí)間60分鐘。分離純化后TLC測(cè)得放化純>94％，比活度>23。 5、25I-EC-ASONDSephadexG-25柱層析分離

6、純化，得到兩個(gè)放射峰，l峰為純化的125I-EC-ASOND，2峰為分子量較小的放射性雜質(zhì)和游離125I。 6、放置5min、30min、60min、120min后再次測(cè)定125I-EC-ASOND的放化純，均>90％。兩組對(duì)比，Iodogen法和氯胺T法所得標(biāo)記產(chǎn)物穩(wěn)定性無差別。 7、MTT法檢測(cè)證明1251標(biāo)記后對(duì)ASODN的生物學(xué)活性影響小。相比氯胺T法標(biāo)記，Iodogen法標(biāo)記對(duì)ASODN的生物學(xué)活性影響更小。

7、 8、顯微鏡觀察：125I-EC-ASODN反義藥物干預(yù)組，細(xì)胞數(shù)減少、細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞核變大、畸形，核仁明顯；胞漿內(nèi)脂滴增多，胞漿內(nèi)有裂痕，線粒體外室輕度腫脹；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集，可見空泡化改變。 結(jié)論： 1、部分硫代修飾ASODN設(shè)計(jì)合理，EC與ASODN合成方法簡單，能形成穩(wěn)定復(fù)合物EC-ASODN； 2、EC-ASODN的1251標(biāo)記方法簡便易行，標(biāo)記率高，比活度符合要求；125I-EC-ASON