葡萄扇葉病毒基因變異分析及分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、葡萄扇葉病毒（GFLV）引起的葡萄扇葉病是全世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的葡萄病毒病害之一。GFLV可導(dǎo)致葡萄產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，并且縮短葡萄園的使用壽命。我國(guó)對(duì)葡萄扇葉病的研究較晚，1980年首次在新疆發(fā)現(xiàn)，至今未獲得中國(guó)GFLV分離物的全基因組序列。為了建立穩(wěn)定、可靠、快速、靈敏的GFLV分子生物學(xué)檢測(cè)方法，并調(diào)查GFLV在我國(guó)的發(fā)生分布情況以及分子變異特點(diǎn)，本研究針對(duì)GFLV開(kāi)展了巢式RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分子檢測(cè)技術(shù)研究，對(duì)

2、來(lái)自全國(guó)19個(gè)省、市、自治區(qū)的376株葡萄樣品進(jìn)行GFLV檢測(cè)，以克隆測(cè)序得到的部分移動(dòng)蛋白（MP）和外殼蛋白（CP）基因序列進(jìn)行變異分析，并展開(kāi)GFLV全基因組序列擴(kuò)增，主要取得了以下研究結(jié)果：
　　根據(jù)GFLV的MP和CP基因分別設(shè)計(jì)引物，研究建立了GFLV的巣式RT-PCR，該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，與常規(guī)RT-PCR相比，具有較高的靈敏度，其中巣式引物FL-MPn1檢測(cè)效果較好。另外，通過(guò)引物選擇、條件優(yōu)化和擴(kuò)增效率比較，建

3、立了以FL-HP1為引物的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測(cè)靈敏度是巢式RT-PCR的10倍。利用建立的熒光定量方法測(cè)定葡萄樣品中GFLV含量，并檢測(cè)58個(gè)葡萄樣品，結(jié)果表明不同葡萄樣品中GFLV含量差異較大，與ELISA和巢式PCR相比，能檢測(cè)出更多的GFLV分離物。
　　對(duì)來(lái)自全國(guó)19個(gè)省、市、自治區(qū)的葡萄樣品用ELISA及巢式RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，巢式RT-PCR檢測(cè)376個(gè)樣品，而ELISA檢測(cè)其中279個(gè)樣品。結(jié)果

4、兩套巢式PCR引物共檢出陽(yáng)性樣品43個(gè)，檢出率11.4％；而ELISA檢出陽(yáng)性樣品61個(gè)，檢出率21.9%；ELISA與巢式RT-PCR總共檢出陽(yáng)性樣品72個(gè)，檢出率為19.2%。19個(gè)地區(qū)中有9地區(qū)檢出陽(yáng)性樣品，檢出率分別在6.1%-54.2%?？偣矙z測(cè)102個(gè)葡萄品種，28個(gè)品種檢出GFLV，品種帶毒率為27.5%，其中檢出帶毒率較高的有：品麗珠、蛇龍珠、貴人香、紅地球、巨玫瑰、赤霞珠。
　　本研究通過(guò)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)

5、序獲得了39條2BMP基因序列和22條2CCP基因序列，序列分析結(jié)果顯示本研究獲得的MP和CP基因間核苷酸序列相似性均較高（94.9-100%），而與其他GFLV分離物的序列比對(duì)結(jié)果顯示：2BMP核苷酸和氨基酸序列相似性分別為78.3-86.6%和89.3-96.4%，2CCP核苷酸和氨基酸序列相似性分別為74.8-83.3%和81.4-91.4%。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，本研究獲得的分離物聚集成一個(gè)獨(dú)立的亞組，表明分離物間起源相同，且進(jìn)化過(guò)

6、程中未受到其他地理起源的GFLV變種的影響。
　　擴(kuò)增得到中國(guó)GFLV分離物GFLV-SDHN的RNA1和RNA2進(jìn)行全基因組序列擴(kuò)增，其RNA1、RNA2全長(zhǎng)核苷酸序列分別為7367 nt、3788 nt（不包括PolyA）。其中GFLV-SDHN的RNA1序列在迄今為止已報(bào)道的所有GFLV分離物中是最長(zhǎng)的，其5’-UTR為266 nt，比其他GFLV分離物長(zhǎng)22–24nt。GFLV-SDHN與其他GFLV分離物的序列及進(jìn)化樹(shù)分