牙齦卟啉單胞菌唾液酸酶基因功能研究.pdf

1、目的：
　　 唾液酸是一種九碳糖酸,在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中唾液酸用于修飾細(xì)胞分子,通常位于糖結(jié)合物如糖蛋白,糖脂的末端,這些糖結(jié)合物在真核細(xì)胞表面,血清及唾液中普遍存在。有實(shí)驗(yàn)表明唾液酸與細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng),細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成及細(xì)菌與細(xì)胞的相互作用有關(guān)。細(xì)菌利用的唾液酸的來(lái)源有兩種:內(nèi)源性合成和外源性分解。有些細(xì)菌本身有合成唾液酸的能力,通過(guò)自身代謝合成唾液酸,即內(nèi)源性合成;而另一些細(xì)菌是通過(guò)唾液酸酶水解糖結(jié)合物最末端的殘基從而獲得唾液

2、酸,即外源性分解。因此細(xì)菌編碼的唾液酸酶及其在不同細(xì)菌中的功能倍受學(xué)者們的關(guān)注。
　　 唾液酸酶是一種水解酶,可以選擇性的水解糖結(jié)合物末端的殘基,從而獲得游離的唾液酸,唾液酸酶分兩類(lèi):內(nèi)切酶和外切酶,外切酶能夠切割α-(2→8)鍵的唾液酸殘基,外切酶能夠切割α-(2→3),α-(2→6),α-(2→8)鍵的唾液酸殘基。實(shí)驗(yàn)表明細(xì)菌的唾液酸酶可能與細(xì)菌的生長(zhǎng)和毒性有關(guān)。Thompson等發(fā)現(xiàn)福賽氏坦納菌唾液酸酶基因(NanH基因)

3、參與唾液酸的代謝;Honma等發(fā)現(xiàn)福賽氏坦納菌的NanH基因同樣參與了福賽氏坦納菌與上皮細(xì)胞的相互作用。此外,Banerjee等研究表明肺炎鏈球菌唾液酸酶與細(xì)菌的內(nèi)化有關(guān)。Tong等研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌唾液酸酶(NanA)突變株喪失了粘附的能力。由此可見(jiàn),唾液酸酶在細(xì)菌的生存和致病過(guò)程中所起的作用不容忽視。
　　 牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是主要的牙周致病菌之一,包

4、含很多毒力因子,如菌毛,蛋白酶等,這些毒力因子在P.gingivalis的粘附和致病過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。通過(guò)P.gingivalisW83全基因組序列我們發(fā)現(xiàn)PG0352是唾液酸酶的同源基因,推測(cè)PG0352在P.gingivalis中編碼唾液酸酶基因,本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)構(gòu)建PG0352突變株研究唾液酸酶基因在P.gingivalis生長(zhǎng)和致病過(guò)程中所起的作用。
　　 材料和方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　

5、1、主要試劑、儀器:
　　 TSB培養(yǎng)基(Fisher,美國(guó))
　　 質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen,美國(guó))
　　 DNA凝膠回收試劑盒(Qiagen,美國(guó))
　　 引物(Integrated DNA technologies,美國(guó))
　　 PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD,美國(guó))
　　 電泳儀(Bio-RAD,美國(guó))
　　 自動(dòng)凝膠成像分析儀(GDS8000,UVP公司,美國(guó))

6、　　 厭氧培養(yǎng)箱(anarobic system,美國(guó))
　　 電穿孔儀(ECM630,BTX公司,美國(guó))
　　 5'RACE試劑盒(Ambion,美國(guó))
　　 紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad,美國(guó))
　　 96孔板(Falcon,美國(guó))
　　 酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國(guó))
　　 DIG標(biāo)記及雜交試劑盒(Roche,美國(guó))
　　 2、實(shí)驗(yàn)菌株,質(zhì)粒及載體:
　　 P.g

7、ingivalis W83
　　 P.gingivalis ATCC33277
　　 P.gingivalis FDC381
　　 齒垢密螺旋體(T.denticota)ATCC33520
　　 E.coli DH5α(NEB,美國(guó))
　　 pGMT easy載體(promage,美國(guó))
　　 質(zhì)粒pVA2198(由紐約州立大學(xué)布法羅分?？谇簧飳?shí)驗(yàn)室Ashu Shama教授饋贈(zèng))

8、　　 質(zhì)粒pPRS415(由紐約州立大學(xué)布法羅分?？谇簧飳?shí)驗(yàn)室Elaine M.Haase教授饋贈(zèng))
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、PG0352編碼蛋白的同源性分析
　　 通過(guò)PUBMED找出功能明確的唾液酸酶基因,通過(guò)Clustal W將PG0352編碼的氨基酸與功能明確的唾液酸酶基因編碼的氨基酸做同源比對(duì)。
　　 2、5'RACE和β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)
　　 提取細(xì)菌RNA,采用CIP酶

9、處理后,TAP去掉5'端的2個(gè)磷酸基團(tuán),在5'端加上adapter,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過(guò)巢氏PCR尋找PG0352的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。將PG0352啟動(dòng)子區(qū)插入到pRS415中,通過(guò)檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性鑒定PG0352啟動(dòng)子區(qū)的作用。
　　 3、構(gòu)建PG0352突變株
　　 (1)細(xì)菌培養(yǎng):P.gingivalis W83菌株接種于新鮮配制的含5％無(wú)菌脫纖維羊血,氯化血紅素(5μg/ml)和維生素K(0.5μg/

10、ml)的TSB培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)5-7天。E.coli DH5α菌株接種于Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基,37℃需氧培養(yǎng)。
　　 (2)質(zhì)粒的構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PG0352上游及下游基因,順式連接到pGMT-easy載體中,PG0352上游及下游基因之間插入BglⅡ酶切位點(diǎn),然后從pVA2198中擴(kuò)增紅霉素基因,將其插入PG0352上游基因和下游基因之間。
　　 (3)質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化及突變株篩選:將100

11、μl P.gingivalis細(xì)胞懸液和1μg構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA加入無(wú)菌電極杯中,電穿孔脈沖為2500 V,5 ms。將電穿孔后細(xì)胞懸液接種于1 ml BHI液體培養(yǎng)基,37℃厭氧培養(yǎng)16 h后,菌液接種于抗性TSB培養(yǎng)基(含5μg/ml紅霉素),37℃厭氧培養(yǎng)7天后收集陽(yáng)性克隆,命名為PG0352突變株。
　　 4、PG0352蛋白抗體的制作
　　 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PG03525'端基因,連接至pQE30表達(dá)載體中,運(yùn)用I

12、PTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),應(yīng)用Ni-NTA純化蛋白,免疫小鼠,收集血清。
　　 5、Southern blot
　　 采用PG0352基因全長(zhǎng)作探針,ClaⅠ租HindⅢ分別酶切細(xì)菌全基因組DNA,轉(zhuǎn)到尼龍膜上,經(jīng)過(guò)固定,預(yù)雜交,雜交,封閉,洗膜,發(fā)光等過(guò)程觀察雜交結(jié)果。
　　 6、Western blot
　　 超聲法制備菌體蛋白,通過(guò)12％SDS膠分離,濕轉(zhuǎn)至PVGF膜上,經(jīng)過(guò)封閉,一抗,二抗及與ECL

13、底物反應(yīng),最后曝光顯影。
　　 7、唾液酸酶活性檢測(cè)
　　 將用PBS洗過(guò)的菌細(xì)胞滴到含有MUN的濾紙上,37℃,孵育15min,ChemiDocXRS成像系統(tǒng)紫外成像。
　　 8、生長(zhǎng)曲線(xiàn)的描繪
　　 將菌液稀釋至OD600=0.005-0.01,繼續(xù)培養(yǎng),定時(shí)檢測(cè)分光光度(波長(zhǎng)600),excel繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
　　 9、生物膜的形成
　　 用1/2TSB在96孔板中厭氧培養(yǎng)細(xì)菌3-4

14、天,加入結(jié)晶紫染液染色,用PBS洗3-4次,95％酒精溶解,酶標(biāo)儀測(cè)OD570。
　　 10、莢膜染色
　　 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的細(xì)菌涂片用復(fù)紅染色,滴入印第安墨水負(fù)染,相差顯微鏡觀察。
　　 11、冰凍掃描體層攝影
　　 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的細(xì)菌,直接置入液氮中,取出4ml液體在輝光啟電源的銅載網(wǎng)上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),選擇合適的細(xì)菌濃度封閉,固定在玻璃質(zhì)中,用電子衍射的方法成像。
　　 12、抗血

15、清試驗(yàn)
　　 收集健康人血清,將P.gingivalis培養(yǎng)基中加25％血清,分別在1小時(shí)和3小時(shí)涂板,計(jì)算生存率。
　　 13、動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌毒力
　　 取10×1010 CFU/ml菌細(xì)胞0.1ml,接種于小鼠背部中線(xiàn)偏0.1cm處皮下,每天觀察老鼠的狀態(tài),體重,皮毛的情況,注射部位有無(wú)紅腫潰爛,其它部位有無(wú)異常等。
　　 結(jié)果：
　　 1、PG0352編碼蛋白同源性分析結(jié)果
　　

16、PG0352基因全長(zhǎng)1580bp,編碼526個(gè)氨基酸。PG0352與綠膿假單胞菌及噬二氧化碳細(xì)胞菌的唾液酸酶基因的同源性分別為46.6％和42.3％,并含有3個(gè)唾液酸酶基因特有的功能基序。
　　 2、PG0352在P.gingivalis標(biāo)準(zhǔn)株中的檢測(cè)
　　 P.gingivalis ATCC33277,P.gingivalis FDC381和P.gingivalis W83均有唾液酸酶基因檢出。
　　 3、PG

17、0352啟動(dòng)子序列檢測(cè)結(jié)果
　　 PG0352基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于-102bp處的“A”,下劃線(xiàn)標(biāo)記的“ATG”為PG0352基因的翻譯起始位點(diǎn),“AAACGG”為富含嘌呤的區(qū)域,啟動(dòng)子-10區(qū)推測(cè)為“TCLTATT”,-35區(qū)推測(cè)為“TTGGGA”。
　　 4、β半乳糖苷酶活性檢測(cè)結(jié)果
　　 插入PG0352啟動(dòng)子序列的pRS415β半乳糖苷酶活性為5190.33±284.02miller,比無(wú)啟動(dòng)子的pRS

18、415β半乳糖苷酶活性高100倍以上,P＜0.01。
　　 5、PCR鑒定PG0352突變株結(jié)果
　　 在PG0352突變株中,通過(guò)雙向交換的方式原PG0352基因被紅霉素基因所取代。
　　 6、RT-PCR鑒定PG0352突變株結(jié)果
　　 PG0352突變株中在RNA水平上沒(méi)有PG0352檢出。
　　 7、Southern,western及唾液酸酶活性鑒定PG0352突變株結(jié)果
　　 P

19、.gingivalis W83野生株P(guān)G0352基因Southern,westerm及唾液酸酶活性結(jié)果均為陽(yáng)性,而PG0352突變株均為陰性。
　　 8、P.gingivalis W83野生株和PG0352突變株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的比較
　　 P.gingivalis W83野生株和PG0352突變株的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著性差異,加入唾液酸酶后兩者間生長(zhǎng)同樣沒(méi)有顯著性差異。
　　 9、P.gingivalis W83野生株和PG0

20、352突變株生物膜形成的比較
　　 與P.gingivalis W83野生株相比,PG0352突變株生物膜形成能力降低,加入唾液酸后PG0352突變株生物膜形成能力有所提高,并呈濃度依賴(lài)性。
　　 10、P.gingivalis W83野生株和PG0352突變株莢膜的比較
　　 P.gingivalis W83有莢膜,厚度大約為20-30nm,較致密,而PG0352突變株形成的莢膜很弱,較松散。
　　 1

21、1、抗血清試驗(yàn)結(jié)果
　　 P.gingivalis W83野生株在25％健康人血清中的生存率高于PG0352突變株,1小時(shí)和3小時(shí)P.gingivalis W83野生株的生存率分別為101.14％±3.96％和77.58％±4.07％,而PG0352突變株的生存率分別為22.37％±4.07％和26.24％±2.53％,P.Gingivalis W83野生株與PG0352突變株相比有顯著性差異P＜0.01。
　　 12、

22、細(xì)菌毒力檢測(cè)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 P.gingivalis W83野生株組在6天內(nèi)三只小鼠均死亡。PG0352突變株組中兩只小鼠在第4天注射部位出現(xiàn)膿腫,膿腫大小為44.16 m2和28.26 m2,第8,9天膿腫破潰,另一只在注射部位沒(méi)有異常,在第6天腹部出現(xiàn)潰瘍,大小為:2mm×2mm。
　　 .結(jié)論：
　　 1、PG0352基因全長(zhǎng)1580bp,編碼526個(gè)氨基酸,有三個(gè)特殊的基序,編碼唾液酸酶。
　

23、　 2、PG0352轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在-102bp處,可能受sigma70調(diào)控。
　　 3、運(yùn)用等位基因同源重組技術(shù)構(gòu)建P.gingivalis PG0352突變菌株。通過(guò)PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR,southern,western,唾液酸酶活性對(duì)PG0352突變菌株進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證,證實(shí)PG0352突變株構(gòu)建成功。
　　 4、與P.gingivalis W83比較,PG0352突變株形成生物膜能力降低,但生長(zhǎng)不受影響。