重組pGH原核表達產物純化及其生物活性研究.pdf

1、本研究首先將克隆到的豬生長激素(pGH)基因cDNA編碼區(qū)片段定向插入pGEX1-λT載體，轉化大腸桿菌TOP10F’，用菌落PCR和質粒PCR方法篩選陽性克??；以BamHI和EcoRI酶切鑒定重組質粒。以IPTG誘導融合蛋白表達，產物經SDS-PAGE分析。得到高效表達豬GH的重組質粒pGEX1-λT-pGH，SDS-PAGE分析證明誘導重組質粒菌株表達了融合蛋白，分子量約為50KDa，與預期的26KDa的GST帶和24.4KDa的豬

2、生長激素基因編碼蛋白質構成的融合蛋白大小一致?！　木郾０分苽淠z中回收正確表達的融合蛋白，以此免疫新西蘭白兔，制備得到滴度為1：6400的兔抗pGH高免血清。在此基礎上，完成了對抗體的純化和鑒定。采用辛酸－硫酸銨法對制得的多克隆抗體進行純化，用紫外分光光度計檢測純化抗體蛋白含量，SDS-PAGE檢測抗體純度，用蛋白質印跡分析和免疫組化分析檢查了純化后抗體的免疫活性。結果顯示：經辛酸－硫酸銨純化抗體純度達到PAGE純，含量為19.

3、2mg/ml；純化后的pGH多抗與從豬垂體提取的天然pGH蛋白分子(24KDa)和表達融合蛋白(50KDa)均有特異性結合能力。純化后的pGH多抗以1：150的滴度檢測到豬垂體前葉細胞的細胞質有pGH免疫陽性信號。在上述基礎上進行了表達包涵體的變性復性研究和重組pGH的生物活性研究。菌體用裂解緩沖液(Tris-HCl50mmol/L,EDTA0.5mmol/L,NaCl50mmol；PH7.9)懸浮，加入20％脫氧膽酸鈉(DOC)水溶液