馬立克氏病毒SC9-2株生物學(xué)活性的比較研究及表達(dá)NDV-F基因重組病毒的構(gòu)建.pdf

1、馬立克氏?。∕arek’s disease，MD）是雞的一種高度接觸性腫瘤病，其主要特征是淋巴組織增生和腫瘤的形成。馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)包括三種血清型：血清1型（MDV-Ⅰ)屬于能引起腫瘤的MDV，血清2型（MDV-Ⅱ）屬于天然不致瘤的MDV，火雞皰疹病毒（HVT)屬于血清3型（MDV-Ⅲ）。2001年，本實(shí)驗(yàn)室張志等從中國廣西省某雞場分離得到一株自然重組禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）

2、長末端重復(fù)序列（LTR）的1型MDV野毒株 GX0101。為了解GX0101的生物學(xué)活性，我們使用細(xì)菌人工染色體（BAC）技術(shù)構(gòu)建了GX0101的BAC克隆BAC-GX0101，在BAC-GX0101的基礎(chǔ)上，敲除兩個致腫瘤的meq基因，同時誘導(dǎo)掉重組過程中插入的Kan+表達(dá)盒，得到了meq基因缺失株MDV GX0101?meq?Kan，即SC9-1株MDV。研究表明，SC9-1株不僅失去了1型MDV的致病性而且能夠提供比商品化CVI9

3、88/Rispens疫苗更好的免疫保護(hù)效果。在SC9-1的基礎(chǔ)之上，我們通過cre-loxp重組系統(tǒng)進(jìn)一步敲除SC9-1中的BAC骨架得到SC9-2株MDV，本研究旨在比較不同代次SC9-2的生物學(xué)活性及以SC9-1為載體構(gòu)建表達(dá)NDV-F基因的重組MDV。
　　1. SC9-1中細(xì)菌人工染色體（BAC）序列自我敲除的分子鑒定
　　為了對缺失meq基因的MDV SC9-1感染性克隆基因組中BAC的自我敲除進(jìn)行分子鑒定。將含有

4、表達(dá)cre重組酶真核表達(dá)盒的SC9-1重組質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）拯救SC9-1重組病毒。將SC9-1重組病毒在CEF細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，利用病毒表達(dá)的cre重組酶在傳代過程中逐步敲除病毒的BAC序列。分別提取1~10代不同代次SC9-1重組病毒的DNA作為模板，利用BAC序列特異性引物對病毒基因組中的BAC進(jìn)行PCR檢測。同時利用針對BAC序列g(shù)pt基因的特異性檢測引物，以MDV保守基因pp38作為內(nèi)參，對不同代次病毒

5、基因組中BAC序列進(jìn)行熒光定量PCR的檢測。利用PCR擴(kuò)增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因組中殘留loxp位點(diǎn)兩端序列，通過測序分析進(jìn)一步驗(yàn)證BAC序列的敲除。利用BAC序列特異性引物對不同代次病毒基因組中BAC序列的檢測結(jié)果顯示：1~5代的病毒DNA均能擴(kuò)增出600 bp的特異性目的條帶，證實(shí)病毒的基因組中含有BAC序列。6~10代病毒DNA均不能擴(kuò)增出特異性目的條帶，證實(shí)病毒的基因組中沒有BAC序列。熒光定量PCR的結(jié)果顯示，病毒

6、基因組中的BAC序列隨著病毒的傳代逐漸減少，直至第6代已經(jīng)完全檢測不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的過程中，對每代病毒BAC序列敲除后殘留loxp位點(diǎn)序列進(jìn)行PCR測序鑒定，結(jié)果顯示BAC序列敲除后基因組中僅留下一個loxp位點(diǎn)，序列同源性均在99.7％以上。結(jié)果表明，利用cre-loxp系統(tǒng)將病毒在CEF細(xì)胞上連續(xù)6代傳代培養(yǎng)可將SC9-1中的BAC序列完全敲除掉，且同源重組酶敲除BAC序列具有高度的一致性。
　　2.馬立克

7、氏病病毒疫苗株SC9-2在CEF細(xì)胞上的傳代致弱及其免疫抑制作用和保護(hù)效果的評估
　　MD是由α-皰疹病毒MDV引起的雞的一種淋巴組織增生性疾病。之前的研究表明，敲除meq基因的超強(qiáng)MDV（vv MDV）能夠提供比商品化CVI988/Rispens更好的免疫保護(hù)，而且在鴨胚成纖維細(xì)胞(DEV)連續(xù)傳40代后能夠消除病毒在母源抗體陰性雞中引起的免疫器官（胸腺和法氏囊）萎縮以及體重的減輕。本研究中，我們將meq基因敲除株SC9-2株M

8、DV在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）上連續(xù)傳代。結(jié)果表明，接種40代SC9-2（SC9-2/40th）的SPF雞的體重及胸腺和法氏囊相對于體重的指數(shù)要高于免疫10代SC9-2（SC9-2/10th）的SPF雞，但都顯著低于空白對照組。SC9-2/40th和SC9-2/10th對于禽流感（AIV）和新城疫（NDV）滅活苗產(chǎn)生的抗體水平差異不顯著，但都低于空白對照組，而且存在顯著差異。接種SC9-2/40th的SPF雞在羽毛囊中的病毒載量要低于S

9、C9-2/10th的病毒載量，但是免疫保護(hù)效果沒有差異，同時免疫保護(hù)指數(shù)明顯好于CVI988/Rispens。所有結(jié)果表明，SC9-2/40th的免疫抑制顯著降低，但仍需要繼續(xù)傳代減弱免疫抑制。本研究為細(xì)胞傳代致弱缺失meq基因的超強(qiáng)MDV提供了依據(jù)。
　　3.表達(dá)NDV-F基因重組MDV的構(gòu)建及其在雞體內(nèi)外的復(fù)制
　　以敲除meq基因的MDV-Ⅰ型弱毒SC9-1（GX0101?meq?Kan）為載體構(gòu)建一株表達(dá)外源基因ND

10、V-F的重組病毒。將外源基因NDV-F的ORF插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）中，擴(kuò)增含有CMV啟動子的NDV-F表達(dá)盒，同時擴(kuò)增篩選基因Kan+表達(dá)盒，將他們插入到載體pMD18-T中。用含有MDV-US2區(qū)50 bp同源臂的引物擴(kuò)增串聯(lián)表達(dá)盒，將產(chǎn)物電轉(zhuǎn)進(jìn)含有SC9-1的EL250宿主菌中，1%阿拉伯糖誘導(dǎo)掉陽性重組病毒基因組中的Kan+表達(dá)盒。挑選敲除Kan+表達(dá)盒的陽性克隆提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞拯救重組病毒。將重組病毒