含REV-LTR基因的馬立克氏病毒活疫苗的生物安全評價及免疫效力研究.pdf

1、雞馬立克氏病(Marek's disease，MD)是以淋巴組織增生、外周神經(jīng)麻痹和臟器、肌肉、皮膚腫瘤為特征的腫瘤性傳染病，嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。馬立克氏病病毒(MDV)在流行過程中，已經(jīng)從溫和型病毒株演進(jìn)化為強(qiáng)毒株，并出現(xiàn)了超強(qiáng)毒株。常規(guī)疫苗對強(qiáng)毒的免疫保護(hù)效果并不理想，對超強(qiáng)毒株免疫保護(hù)更是不盡人意。科學(xué)家利用各種方法構(gòu)建MDV候選疫苗，特別是利用基因工程研發(fā)重組疫苗成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)及突破點(diǎn)。目前有已經(jīng)分離到多株自然整合有禽

2、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)的長末端重復(fù)序列（LTR）的馬立克氏病病毒。最近研究表明REV的LTR可能賦予這種重組病毒某種選擇性優(yōu)勢，LTR較強(qiáng)的啟動子和增強(qiáng)子作用不僅能增強(qiáng)親本病毒復(fù)制，而且不改變親本病毒毒力，從而提高疫苗免疫力，這一優(yōu)勢為利用LTR改良馬立克疫苗提供了保障。前期用MDV（JM/102W株）和REV（CSC株）混合感染鴨成纖維細(xì)胞(DEF)，隨后將細(xì)胞懸浮液接種于雞，在雞的羽毛囊內(nèi)分離到一株含有LTR的重組馬立克氏

3、病病毒，并將該病毒中的LTR的基因片段連接到含有馬立克氏病毒同源臂載體B40中，構(gòu)建了帶有LTR的供體穿梭質(zhì)粒，并與CVI988/Rispens病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，在細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生整合有LTR的CVI988/Rispens重組馬立克氏病病毒（rMD V-L TR）。本研究對rMDV-LTR進(jìn)行生物安全評價和免疫效力試驗(yàn)，期望得到免疫保護(hù)作用好而又安全的重組馬立克氏病毒活疫苗，開發(fā)一種能作為表達(dá)保護(hù)性

4、抗原基因的活疫苗載體。
　　1、含REV-LTR基因的重組馬立克氏病毒生物學(xué)特性及感染與排毒檢測
　　將重組MDV分別通過雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和SPF雞的連續(xù)傳代增殖，通過PCR法鑒定LTR基因是否插入，以及確定LTR在IRS和TRS的存在，進(jìn)一步用測序的方法評價重組病毒插入基因的穩(wěn)定性。在1日齡SPF雞皮下接種重組MDV，通過非免疫同居雞的羽囊和血液進(jìn)行病毒分離、PCR檢測等評估重組病毒水平傳播能力。對1日齡雞接種重組

5、MDV后，通過對飼料、飲水、糞便、墊料等的病毒分離、PCR檢測評估疫苗毒株在環(huán)境中的存活能力，通過對免疫雞的組織病毒分離、PCR檢測等評估重組病毒在免疫雞體內(nèi)的分布情況。試驗(yàn)結(jié)果表明重組馬立克氏病病毒在CEF生長良好，以50-60 PFU/ml的病毒滴度感染CEF細(xì)胞，生長曲線結(jié)果表明，rMD V-L TR在培養(yǎng)前3d空斑較少，在4d空斑開始增加，在第5d生長速度迅速加快，可持續(xù)增長到7d。相比CVI988/Rispens母本株，在第2

6、d開始出現(xiàn)空斑，從第3d開始勻速生長到第6d生長達(dá)到高峰，隨著病毒的傳代病毒的繁殖能力不會改變。PCR及測序表明，插入片段LTR基因在傳代病毒中穩(wěn)定存在，且沒有基因突變和缺失。重組馬立克氏病毒經(jīng)SPF雞體內(nèi)傳代5代后，剖檢沒有明顯肉眼病變，內(nèi)臟組織結(jié)構(gòu)清晰，沒有明顯病理變化。重組MDV接種1日齡SPF雞，同時以母本株CVI988/Rispens做對照，非免疫同居雞的組織病毒分離和PCR檢測結(jié)果表明，重組馬立克氏病毒具備向同居非免疫雞進(jìn)行

7、水平傳播的能力。排毒檢測試驗(yàn)未從飼料、糞便、飲水及棉拭子中分離到病毒，因此重組病毒和CVI988/Rispens具有同樣的安全性。
　　2、含REV-LTR基因的重組馬立克氏病毒免疫效力研究
　　將1日齡SPF雞分成8組，每組20只，皮下免疫0.2 mL的重組MDV，劑量分別為500 PFU/只、750 PFU/只、1000 PFU/只、2000 PFU/只和3000 PFU/只，同時CVI988/Rispens母本株200

8、0 PFU/只和3000 PFU/只(0.2 mL)作為陽性對照，PBS0.2 mL作為陰性對照。接種10天后，各組分別以500 PFU/只(0.2 mL)的劑量接種vv MDV rMd5。攻毒后的每天跟蹤記錄各組有無臨床癥狀或死亡情況。飼養(yǎng)60天后，全部撲殺并剖檢觀察其病變。采集疑似MDV病變的組織、臟器，然后每組隨機(jī)選取5只分別取其組織、臟器做石蠟切片，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，最后疫苗免疫效力由保護(hù)指數(shù)來評價。試驗(yàn)結(jié)果表明攻毒

9、對照各組死亡率為85％，其余各組精神、采食和飲水正常，內(nèi)臟組織器官和組織切片的檢查均未發(fā)現(xiàn)病理變化。因此，重組MDV與母本毒株具有相同的免疫保護(hù)效力。
　　3、含REV-L TR基因的重組馬立克氏病毒對靶動物、非靶動物的安全性評價
　　將含REV-LTR基因的重組MDV、母本病毒CVI988/Rispens與PBS作對照，分別通過皮下注射途徑對1日齡敏感雛雞進(jìn)行一次單劑量、單劑量重復(fù)和一次大劑量免疫的安全性試驗(yàn)，對1日齡雛鴨